メソテトラキス（p-スルホン酸-フェニル）ポルフィリンによるシステイン被覆CdSe / ZnS量子ドット発光の刺激

背景

コロイド状半導体ナノクリスタルまたは量子ドット（QD）は、その特定の特性、サイズに依存する最大位置、高い熱および光安定性を備えた強力な広い吸収および狭い発光スペクトル[1、2]により、現代技術のさまざまな分野での用途があります。医療用イメージングおよび診断、最新のコンピューティングナノデバイス、生物分析アプリケーション用の蛍光プローブ、光電気化学水素生成など（[3,4,5,6,7]およびその中の参考文献）。 QD表面を有機分子で機能化することにより、水への溶解度を高め、毒性を減らし、生体適合性を高め、生物の望ましい構造に選択的に親和性のあるQDを調製することができます[8]。したがって、QDは、生物学[5]および医学[6]でのアプリケーションに特に関心を集めており、蛍光診断（FD）[9]の蛍光プローブ（FP）および光線化学療法（PCT）の光増感剤（PS）として正常に適用できます。 [10]。広いスペクトル領域での強い吸収により、QDは光エネルギー蓄積に効果的なアンテナになり、強い狭い発光帯域は対応するPSへのエネルギー伝達を促進し、光エネルギー利用の効率を高め、その結果PSの有効性を高めます[7、11]。 。これにより、（QD + PS）ペアは、FDとPCTでのアプリケーションに有望であり、QDとFSの相互作用、特にそれらの間のエネルギーと電荷の移動に関する研究を刺激します。

とりわけ、システインコーティングされた（CdSe / ZnS）QD（（CdSe / ZnS）-Cys QD）および meso -テトラキス（p-スルホン酸-フェニル）ポルフィリン（TPPS ₄ ）次の理由により、特別な関心を集めています。システインコーティングされたQD（QD-Cys）のサイズが小さいため、細胞膜に浸透する移動性と確率が高くなり、化学的安定性が高く、非特異的吸着が低く、発光量子収率が高くなります。 12、13]。一方、合成TPPS ₄ ポルフィリンは、光活性、水溶性、非毒性であり、光線力学療法（PDT）での応用においてすでに診療所でテストされており、有望な特性を示しているため、有望なPSです[14、15]。

TPPS ₄ 間の相互作用 エネルギーおよび/または電荷移動を介したQDはすでに文書化されています[16]。一般的に、これらのプロセスは、QD発光強度と寿命の低下を伴います。 QDで発光の自己消光を引き起こすもう1つのプロセスは、静電相互作用または水素結合形成を介した自己凝集であり、多くの場合、凝集プロセスを可逆的にします[17]。

この研究では、（CdSe / ZnS）-CysQDおよびTPPS ₄ の例で、ポルフィリンとの相互作用を介したQD発光の刺激について初めて報告します。 ポルフィリン。

実験的

（CdSe / ZnS）-Cys量子ドットの準備

（CdSe / ZnS）-Cys QDは、[18]から採用された方法に従って合成されました。この方法には、（1）コロイド状の疎水性CdSeコアナノ結晶の合成、および（2）CdSeコアの周りのエピタキシャルZnSシェルの成長が含まれます。 QDをシステインで機能化するために、得られたCdSe / ZnSコアシェルQD（〜3.0 mg）を、クロロホルム（500 mL）に3回分散させ、メタノール（800 mL）で沈殿させることによりTOPOから精製しました。精製したQDをクロロホルム（1.0 mL）に再分散させました。メタノール中のDL-システイン（30 mg mL ^{− 1} 、200 mL）をQD分散液に滴下し、激しく混合した後、遠心分離（10,000 rpm、5分）してクロロホルムを除去しました。メタノールで洗浄して過剰なDL-システインを遠心分離（16,000 rpm、10分、3回）で除去した後、QD沈殿物を真空下で乾燥させ、1 M NaOH（20 mL）を含むMilli-Q水に再分散させました。さらに、シリンジフィルターAnotop 25 Plus（0.02μm、Whatman）でろ過しました。

ポルフィリン+（CdSe / ZnS）-CysQDサンプルの調製

TPPS ₄ ポルフィリンはMidcenturyChemicals（USA）から入手し、さらに精製することなく使用しました。実験溶液は、Milli-Q品質の水を使用して、リン酸緩衝液（pH 7.3; 7.5 mM）で調製しました。 （CdSe / ZnS）での発光測定の場合-Cys QDを276Kで3か月間保持（エージングQD）、濃縮TPPS ₄ のアリコート ストック溶液（[TPPS ₄ ] _在庫 =140μM）を（CdSe / ZnS）-Cys QD初期溶液に追加し、希釈効果を回避しました。老化したQD希釈実験では、最初の溶液のアリコートを同量のリン酸緩衝液に置き換えました。すべての実験は室温（297 K）で実施されました。

TPPS ₄ の濃度 ε _515nm を使用して分光光度的に制御されました =1.3×10 ⁴ M ^{− 1} cm ^{− 1} [19]。老化した（CdSe / ZnS）-Cys量子ドットの濃度は、εを使用して520nmでの最初の励起子吸収ピークを使用して計算されました。 =5857（ D ） ^2.65 Yuの経験的計算[20]によると、ここで D （nm）は与えられたナノ結晶の直径です。 D 値は、[20]に示されている曲線の経験的フィッティング関数から決定されました。 CdSeナノ結晶の場合、この関数は次のとおりです。

私たちの場合、λ =520 nm、 D =2.6 nm、およびε =7.4×10 ⁴ M ^{− 1} cm ^{− 1} 。

楽器

吸収スペクトルは、Beckman CoulterDU640分光光度計でモニターしました。定常状態の発光測定は、HitachiF-7000分光蛍光光度計でλで行われました。 _ex =480nmおよびλ _em =558nm。老化したQD発光量子収率（QY）は、単一点測定λを使用した相対法[21]によって決定されました。 _ex =480nmおよびλ _em =558 nm、1-パルミトイル、2-（12- [N-（7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル）アミノ]ドデカノイル）-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（C12 -NBD-PC）を標準として（エタノール中のQY =0.34）[22、23]式に従って：

ここで私 _fl および私 _fl0 QDおよびC12-NBD-PC、 A の積分蛍光強度です。 および A ₀ λでの吸光度です _ex =480 nm、および n および n ₀ それぞれ、使用した溶媒の屈折率です。

時間分解実験は、時間相関単一光子計数法に基づく装置を使用して実施された。励起源は、Millenia X SpectraPhysics固体レーザーによって励起されたTsunami3950 SpectraPhysicsチタンサファイアレーザーでした。レーザーパルスの繰り返し周波数は、3980 SpectraPhysicsパルスピッカーを使用して8.0MHzでした。レーザーは、第二高調波発生器のBBO結晶（GWN-23PLスペクトル物理学）がエジンバラFL900分光計に向けられた480nmの励起パルスを与えるように調整されました。分光計はL字型構成で、発光波長はモノクロメーターで選択され、発光光子は冷蔵浜松R3809Uマイクロチャンネルプレート光電子増倍管で検出されました。機器の応答関数の半値全幅（FWHM）は通常100 psであり、時間分解能はチャネルあたり12psでした。 Edinburgh Instrumentsが提供するソフトウェアと市販の「OriginPro9」ソフトウェアを使用して、実験的な発光減衰曲線を適合させました。

適合の質は、減少した統計パラメータの分析によって評価されました-χ ² 残差分布の検査によって。

動的光散乱は、40 mW HeNeレーザー（Brookhaven Instruments Corporation）を使用して640nmで励起するNanoBrook90PlusZeta粒子サイズアナライザーで測定しました。

結果と考察

新たに調製された（CdSe / ZnS）-Cys QDは、Liu et al。によって以前に報告されたように、558 nmで最大の発光スペクトルを持っています（図1、黒い線）。 [13]、および量子収率（QY）0.75 [2、24、25]。 TPPS ₄ の追加 新鮮な溶液に加えると、QD発光強度と発光スペクトルプロファイルの両方に変化は生じません。

（CdSe / ZnS）の正規化された発光スペクトル-pH 7.3のリン酸緩衝液（7.5 mM）中のCy​​s 558量子ドット：新たに調製（黒線、λ _max =558 nm）、冷蔵庫で276 K（QD熟成）で3か月後、TPPS ₄ なし （赤い線、λ _max =556 nm）、および[TPPS ₄ の追加時 ] =5.0μMから経年QD（青い線、λ _max =559 nm）、λ _ex =480 nm

（CdSe / ZnS）-Cys QDを水に溶解し、276 Kで3か月間冷蔵庫に保管した場合（エージングQD）、pH 7.3のリン酸緩衝液（7.5 mM）で測定した発光スペクトルの最大値の位置。 2 nm（λ）ブルーシフトされました _max =556 nm）、新鮮なQDと比較して。発光バンドは広く、わずかに非対称に見えました（図1、赤い線）。上記の方法で測定した、老化したQD発光の量子収率は0.23±0.03でした。

TPPS ₄ の追加 老化したQD溶液に対して、発光強度の有意な増加を引き起こし（図2a）、QY値は0.75±0.08に達し（図2a、挿入図）、値は新鮮なQDの値に近づきました[2、24、25]。

a TPPS ₄ の関数としてのエージング（CdSe / ZnS）-Cys 558 QD（[QD] =570 nM、黒い曲線）ソリューションの発光スペクトルと量子収率（挿入図） ポルフィリン濃度。 b QD発光の崩壊速度と\（{I} _ {0_3} / \ left（{I} _ {0_2} + {I} _ {0_3} \ right）\）比（挿入図、式（3）を参照） ）TPPS ₄ の関数として ポルフィリン濃度

さらに、TPPS ₄ の存在下で 、老化した量子ドットの発光バンドの対称化とその帯域幅の減少が観察され、λまでの最大の赤方偏移を伴いました。 _max =559 nm、新鮮なQDスペクトルの最大値に近い（図1、青い線）。

新鮮なQDと古いQDの両方の溶液について、480 nmの励起で得られた発光減衰曲線を、3つの指数の合計として連続的にフィッティングしました。

ここで、\（{I} _ {0_i} \）およびτ _i i の前指数因子（振幅）と寿命です それぞれ-番目の減衰成分。

新鮮なQDと古いQDの両方のコンポーネントの寿命は、ポルフィリンの存在とは無関係です（表1）。新鮮なQD溶液の発光寿命は、（CdSe / ZnS）-Cys QDで一般的です[26、27]。古くなったQDの場合、コンポーネントの寿命ははるかに短くなります（表1）。

τの値 ₁ すべての場合において、ポルフィリンの存在下および非存在下での新鮮なおよび老化したQDは、この研究で使用された単一光子計数装置（≈100ps）の時間分解能に近いです。したがって、それは励起パルスの散乱光と関連している必要があります。

短命（τ）であることは十分に確立されています[28,29,30] ₂ ）および長寿命（τ ₃ ）成分は、QDコア（τ）の電子正孔消滅から生じる発光に関連しています。 ₂ ）およびシェル（τ ₃ ）、 それぞれ。これら2つの成分の合計強度は、QDの消滅プロセス全体を特徴づけます。この場合、τの相対強度（振幅） ₃ コンポーネントは、QDシェルでの電子正孔消滅の寄与を示す必要があります。相対的な貢献度 I ₃ 減衰曲線に対する3番目の成分の割合は次のように計算されました：

TPPS ₄ の追加 新しいQDソリューションでは、コンポーネントの相対的な含有量は大幅に変化しません（データは表示されていません）が、古いQDソリューションの場合、τの相対的な含有量は変化しません。 ₃ コンポーネント I ₃ TPPS ₄ とともに増加します 濃度（図2b、挿入図）。老化した量子ドット発光のQYのTPPS ₄ への依存性 濃度は I の濃度と同じです ₃ （図2a、b、挿入図）、どちらも約2.0μMTPPS ₄ で最大値に達します 。これは、TPPS ₄ 古くなったQDと相互作用すると、QDシェルの発光がコアの発光よりも強くなります。ただし、TPPS ₄ 新鮮なQD溶液では、QD発光に影響を与えません。したがって、TPPS ₄ 老化したQD溶液で観察された効果は、QD表面に結合するポルフィリンでは説明できません。

一方、TPPS ₄ との相互作用で観察された、老化したQD発光強度の増加 TPPS ₄ からの逆エネルギー伝達では説明できません TPPS ₄ 以降、QDに 蛍光スペクトルはλの範囲に局在しています> 600 nm、QD吸収が弱い場合（追加ファイル1：図S3）。したがって、Förster共鳴エネルギー移動（FRET）メカニズムを介したエネルギー移動の可能性は低いです。さらに、QD発光は460または480 nmで励起され、TPPS ₄ 光吸収はごくわずかです。さらに、TPPS ₄ の吸収スペクトル 混合溶液では変化がなく、QDとTPPS ₄ の間に電荷移動がないことを示しています。 （追加ファイル1：図S4b、c）。

QD表面グループ間の非共有NH···H水素結合の形成を介して凝集する量子ドットの能力はすでに文書化されています[13、17]。凝集はQD発光を低減し、QDシェルに起因する成分を最も効果的に消光します[13、17]。 3D凝集体の形成により、固体膜のCdSe-QDでQD発光強度と寿命の低下が観察されました[31]。著者らは、この削減が集合体の個々のQD間のエネルギー移動に関連するモデルを提案しました[32]。

この証拠に基づいて、冷蔵庫にいる間、QDは凝集し、発光強度と寿命が短くなると考えています。したがって、TPPS ₄ の存在下で観察されたQD発光強度と寿命の増加を関連付けます TPPS ₄ によって刺激された、QD分解を伴う 骨材との結合時。フッ素イオンとの相互作用で凝集したQDの放出についても同様の効果が観察されました[17]。

老化したQDで観察された発光バンドプロファイルの変化（図1）は、QD凝集によっても説明できます。また、その非対称性は、さまざまな種類の凝集体の存在に関連しています。 TPPS ₄ との相互作用 凝集を減らし、新しい溶液で観察される非凝集QDの発光バンドプロファイルと同様の発光バンドプロファイルを作成します。

中性pHでは、QD-Cys表面は、その表面の末端アミノ基の脱プロトン化により負の正味電荷を持ちます[17、33、34]。このpHでは、TPPS ₄ 構造内に4つの負に帯電したスルホン酸フェニル基があるため正味電荷（4-）を持ちます（[35、36]およびその中の参考文献）。したがって、QDシステイングループとTPPS ₄ の間の相互作用 静電反発力があるため、分子の可能性は低くなります。しかし、金属表面に対するポルフィリンπ共役系の高い親和性は十分に立証されています[37]。この親和性はTPPS ₄ の原因となるはずです QDとポルフィリン側基の間の静電反発にもかかわらず、量子ドット表面での結合。 QD表面と結合ポルフィリンのπ共役系との相互作用は、ポルフィリン蛍光スペクトルの弱い広がり（図1、3、および追加ファイル1：図S3a、挿入図）と蛍光励起スペクトルの観察された変化（追加ファイル1：図S5b、挿入図）[38]。

TPPS ₄ の正規化された発光スペクトル さまざまなTPPS ₄ 用のリン酸緩衝液（7.5 mM、pH 7.3） 老化した（CdSe / ZnS）の存在下での濃度-Cys 558量子ドット（570 nM）、λ _ex =460 nm

一部のポルフィリン分子がQD表面に結合すると、QD表面の負電荷が増加するため、粒子間の静電反発力が増加し、粒子の脱凝集が誘発されます（スキーム1）[39]。

老化した（CdSe / ZnS）-Cys 558QDとTPPS ₄ 間の相互作用のスキーム 中性pHのポルフィリン。金属表面に対するポルフィリンπ共役系の高い親和性により、ポルフィリン分子はQD表面に吸着し、QD表面の正味の負電荷を増加させ、粒子間の静電反発力を増加させ、粒子の脱凝集を誘発します

QD表面積 A _QD ≈145nm ² いくつかのTPPS ₄ を吸着するのに十分です 分子（ A _TPPS4 ≈1.8nm ² 単位あたり）[40]、磁性および金のナノ粒子と相互作用するポルフィリンで観察された[41、42]。

QDの全領域をポルフィリンでカバーするには、個々のQDあたり80個のポルフィリン分子が必要です。ただし、発光QYと I の飽和 ₃ 570 nM QDソリューションの値は、約[TPPS ₄ で観察されました。 ] =2.0μM（図2）。これは、QDごとに4つのポルフィリン分子の結合がQDの分解に十分であることを示しています。これは、QDと結合したポルフィリンとの間に強い静電反発力を生成するQD（追加ファイル1：図S6）と比較して、ポルフィリン分子の電荷密度が大きいことで説明できます。確かに、高齢者のQDのゼータ電位（ζ _QD ）は− 36.1 mVであり、TPPS ₄ の場合 分子（ζ _TPPS4 ）は− 37.6mVです。 σ=ζ/ A _QD として計算された平均電荷密度 、個人の高齢者のQDは

σ _QD =− 36.1 mV / 145 nm ² =− 0.25 mV / nm ² 。

同時に、4つのTPPS ₄ でバインドされた個々の高齢者のQDの場合 分子、平均電荷密度（σ _{QD + TPPS4} ）は

σ _{QD + TPPS4} =−（36.1 + 37.6×4）mV / 145 nm ² =− 1.29 mV / nm ² 。

したがって、4つのTPPS ₄ の結合 個々の老化したQDを持つ分子は、そのσを5倍以上増加させ、静電反発力を25倍以上増加させ、老化したQDの分解を引き起こします。

QD集約仮説によれば、TPPS ₄ によって誘発される効果と同様の効果 添加は、老化したQD溶液の希釈時に観察する必要があります。実際、緩衝液の希釈時にQD発光のQYの増加が観察されました（図4a、挿入図）。これは、老化したQD-Cys溶液でのQD発光の自己消光がQD濃度に依存することを示しています[17]。 。同時に、 I ₃ QD発光速度の値は、希釈とともに増加します（図4b、挿入図）。

a 老化した（CdSe / ZnS）-Cys 558 QD溶液の発光スペクトルと量子収率（挿入図）（濃度の関数）。 b QD発光と I の崩壊速度論 ₃ 濃度の関数としての値（挿入図、式（3）を参照）

さらに、動的光散乱実験は、D _hd エージング後のQD溶液中の散乱粒子の割合は（330±170）nmであり、これは新鮮なQDのそれよりもはるかに大きいです。希釈によりD _hd が減少します （25±6）nmまで下げると、QDの分解が直接示されます（追加ファイル1：表S1）。

この問題にはもう1つ興味深い側面があります。それは、TPPS ₄ を追加できるかどうかです。 新鮮なQDの溶液に、低温での保存中の凝集を防ぎ、発光特性を安定させますか？ただし、この問題を解明するには、さまざまな実験方法と、試薬濃度、温度、溶液の保管期間（数か月）などのさまざまな実験条件を使用した、独立した詳細な調査が必要です。この深遠な調査は、最寄りの地域で実現する予定です。未来。

結論

得られたデータに基づいて、低温でも水溶液中にCdSe / ZnS-Cys QDを長期間保存すると、それらの凝集が誘発され、発光量子収率と寿命が低下すると断言できます。 TPPS ₄ の追加 ポルフィリンは、老化したCdSe / ZnS-Cys QDの脱凝集を刺激します。これは、QD発光量子収率の増加と、QD発光全体におけるQDシェルの電子正孔消滅の寄与によって顕著になります。ポルフィリンによって刺激された分解は、負に帯電したポルフィリン分子との結合時に凝集したQD間の静電反発力が増加するために発生します。 QD溶液の希釈でも分解が観察されています。

得られた結果は、溶液にいくつかの分子またはイオンを追加し、QDの分解を刺激し、それらの発光特性を復元することによって、老朽化し​​たQDを修復する方法を示しています。これは、バイオイメージングや蛍光診断などのQD生物医学アプリケーションにとって重要です。一方、分解は、粒子のサイズを小さくし、細胞膜を越えて生細胞への内在化を促進するため、生物学や医学のQDアプリケーションにとって重要です。

略語

C12-NBD-PC：

1-パルミトイル、2-（12- [N-（7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル）アミノ]ドデカノイル）-sn-グリセロ-3-ホスホコリン

FD：

蛍光診断

FP：

蛍光プローブ

FWHM：

半値全幅

PCT：

光線化学療法

PDT：

光線力学療法

PS：

光増感剤

QD：

量子ドット

QD-Cys：

システインコーティングされたQD

QY：

量子収率

TOPO：

トリオクチルホスフィンオキシド

TPPS _{4 4} ：

メソ -テトラキス（p-スルホン酸-フェニル）ポルフィリン