CCRF-CEMのターンオン検出のための酸化グラフェンベースの蛍光アプタセンサー

背景

白血病は攻撃的で一般的な悪性造血疾患であり、特に子供や青年にとって、人間の生存と健康への脅威です[1、2]。体の正常な造血細胞だけでなく、骨髄や免疫系にも影響を及ぼします[3,4,5]。したがって、治療のための白血病の早期診断と患者の生活の質の向上が不可欠です。現在、白血病を検出するために一般的に使用されている方法は、末梢血細胞と骨髄を採取することであり、その後、細胞形態、細胞化学[7,8,9]、免疫表現型[10、11]、免疫組織化学を含む多くの種類の分析[6] [12、13]、およびアプタマーベースのフローサイトメトリー[14、15]が実施されています。これらの方法は白血病細胞を検出することができますが、それでも高コスト、低感度、複雑さなどの多くの欠点があります。したがって、白血病を検出するための低コストで高感度で簡単な方法を見つけることが非常に急務です。

短い一本鎖DNA（ssDNA）またはRNAであるアプタマーは、指数関数的濃縮（SELEX）によるリガンドの系統的進化のin vitroスクリーニングによってスクリーニングされました[16、17]。特殊な三次構造に基づいて、アプタマーは、有機小分子、タンパク質、さらには細胞を含む標的との強い結合親和性と高い特異性を持っています[18、19、20]。さらに、アプタマーは、合成および修飾が容易であるという特徴も備えているため、癌検出プローブとして広く使用されています[21]。癌を検出するためのアプタマーに基づく機能化ナノ材料も、量子ドットやシリカナノ粒子[24]などの近年のホットスポットです[22、23]。

酸化グラフェン（GO）は、新しい二次元平面カーボンナノ材料として、優れた水溶性[25]、大きな比表面積、優れた蛍光消光能力[26、27]などの独自の特性により大きな注目を集めています。これらの特性に基づいて、GOは蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）の優れたエネルギー受容体であると考えられており、GOは蛍光アプタセンサーで幅広い応用の可能性を秘めています[28]。さらに、GOはπによってアプタマーに結合することができます -π スタッキング相互作用。ただし、二本鎖DNAまたはアプタマー-ターゲット複合体とは相互作用しません[19、29、30]。したがって、グラフェンベースのアプタマーセンサーは、遊離アプタマープローブと比較してアプタマーの安定性を向上させることができます[31]。

現在、多くの研究が、検出標的のための酸化グラフェンベースの蛍光アプタセンサーの戦略が実行可能であると報告しました[21、32]。それにもかかわらず、これまでのところ、白血病細胞に対してGOベースのアプタセンサーを使用して実施された研究はほとんどありません。ここでは、GOおよびカルボキシフルオレセイン標識Sgc8アプタマー（FAM-apt）に基づいて、白血病細胞のシグナル「ターンオン」検出のための新しい戦略を設計しました。 GOおよびアプタマーをそれぞれ蛍光消光剤および標的剤として使用した。白血病細胞がない場合、GOはFAM-aptと相互作用し、ほとんどすべての蛍光を消光し、検出信号をオフにします。しかし、標的細胞が存在する場合、アプタマーは積極的に細胞を標的とし、GOから脱落するため、検出システムで蛍光が回復し、検出信号がオンになります。したがって、蛍光強度の変化に応じて標的細胞濃度を測定することができます。

メソッド

試薬

5'-FAM-AT CTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA-3 'の配列を持つFFAM-aptは、Sangon Biotech Co.、Ltd。（Shanghai、China）によって合成されました。この作業では、20 mM Tris-HCl（pH 7.4）、5 mM MgCl ₂ を含む自己調節型Tris-HClバッファーを使用しました。 、および100 mMNaCl。この実験で使用したアプタマーは、Tris-HClバッファーで溶解しました。酸化グラフェン粉末は、Xianfeng Nano Materials Tech Co.、Ltd。（Nanjing、China）から購入しました。すべての溶液は、Milli-Q精製システム（Millipore、米国マサチューセッツ州ベッドフォード）から精製された18MΩの超純水で調製されました。

セル

CCRF-CEM（ヒト急性白血病リンパ芽球細胞株）、Ramos（ヒトバーキットリンパ腫細胞株）、293T（ヒト胎児腎臓細胞株）、およびH22（マウス肝細胞癌細胞株）細胞株は、中国のセルバンクから購入しました。科学アカデミー（上海、中国）。すべての細胞株は5％二酸化炭素および37°Cで培養され、1640の培地には10％ウシ胎児血清（FBS; HyClone）および100 U / mLペニシリン-ストレプトマイシン（Gibco、Grand Island、NY、USA）が含まれています。

装置

すべての蛍光スペクトルおよび蛍光強度は、F-7000蛍光分光光度計（日立製作所、東京、日本）によって測定および記録された。 700μLの石英キュベットを使用してサンプル溶液を保持しました。カルボキシルフルオレセイン（FAM）の特徴的なピーク波長により、490 nmでサンプルを励起し、518nmで発光を測定することで発光強度をモニターしました。

すべての原子間力顕微鏡（AFM）イメージングは​​、SPI3800N顕微鏡（セイコーインスツル工業株式会社、東京、日本）によって撮影されました。

GO、FAM-apt、および酸化グラフェン-アプタマー複合体（GO-apt）のゼータ電位は、ナノ粒子サイズ、ゼータ電位、および絶対分子量アナライザー（Zetasizer Nano ZS、Malvern、UK）によって決定されました。

GO、FAM-apt、およびGO-aptのUV-可視吸収スペクトルは、NanoDrop 2000（Thermo、USA）で記録されました。

GO-apt蛍光アプタセンサーの準備

酸化グラフェン粉末をMilli-Q精製水に溶解して分散させた後、超音波で分散させて、1 mg / mLの濃度の均一な黒色溶液を得ました。ストック溶液を20mM Tris-HClバッファーで希釈すると、20 nMFAM-aptの濃度が得られました。その後、調製した1μLのFAM-apt（10μM）と10μLのGO溶液（1 mg / mL）を混合し、Tris-HClバッファーで500μLに希釈しました。

細胞イメージング

CCRF-CEMおよびRamos細胞を6ウェルプレート（5×10 ⁵ ）で12時間培養しました。 ウェルあたりの細胞数）。細胞を冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回洗浄し、GO-apt溶液とともに暗所で4°Cで30分間インキュベートしました。次に、細胞を3回洗浄し、4％ポリオキシメチレンで20分間固定しました。細胞を再度PBSで洗浄し、4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩（DAPI; Life Co.、USA）で暗所で5分間染色しました。最後に、細胞をPBSで3回洗浄し、蛍光顕微鏡（Nikon DS-Ri1;日本）で検査しました。

CCRF-CEMセルの検出

CCRF-CEM細胞を遠心分離によって収集し、1mLのPBSに懸濁しました。 CCRF-CEM細胞のさまざまな濃度（0〜1.0×10 ⁷ / mL）を、GO-apt蛍光アプタセンサーとともに4°C、暗所で30分間インキュベートしました。インキュベーション後、CCRF-CEM細胞は、560〜500nmの波長範囲で蛍光分光法によって検出されました。検出限界（LOD）は、3 σに基づいて推定されます。 / S 計算、ここでσ はGO-aptソリューションの標準偏差です（ n =10）および S は一次方程式の傾きです[33]。

特異性アッセイ

GOベースの蛍光アプタセンサーの特異性を調査するために、Ramos細胞、H22細胞、293T細胞などのいくつかの異なる細胞でシステムをテストしました。 100μLの各反応システムには、1×10 ⁶ が含まれていました。 セル。

統計分析

各実験を3回繰り返した。データはソフトウェアSigmaPlot12.5で処理され、統計分析はGraphPad Prism 6.02（GraphPad Software、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して実行されました。すべての分析における有意性のしきい値は P でした <0.0001。

結果と考察

CCRF-CEMの検出のためのGO-apt蛍光アプタセンサーの原理

この研究では、GOとFAM-aptを使用して、CCRF-CEM細胞を検出するための蛍光アプタセンサーを設計しました。 CCRF-CEM細胞を検出するための蛍光センサーの原理を図1に示します。CCRF-CEM細胞がない場合、FAM修飾アプタマーはπによってGO表面に吸着されます。 -π スタッキング。 GOとフルオロフォアはエネルギー移動に近すぎるため、消光剤として、GOはFAMの蛍光を消光します。 CCRF-CEM細胞の存在下では、GO-アプタマーの弱い結合力により、アプタマーがGO表面から落下して細胞に結合し、蛍光が回復します。したがって、FAM蛍光強度の回復に応じてCCRF-CEM細胞の数を対応して検出することができます。

CCRF-CEM細胞を検出するためのGO-apt蛍光アプタセンサーの概略図

蛍光消光と回復

GOの蛍光を消光し、CCRF-CEM細胞の存在下で蛍光を戻すこの連続プロセスは、蛍光分光光度計で観察できます。 GO蛍光アプタマーに基づくセンシングの全プロセスを図2aに示します。 25 nM Tris-HClバッファー中のFAM-aptの蛍光スペクトルは、FAMの存在により強い蛍光強度を示します（図2a、曲線a）。しかし、GOを添加すると、蛍光強度が著しく低下し（図2a、曲線b）、GOとアプタマーが互いに接近して吸着したときにGOが効率的に蛍光を消光できたことを示しています。驚いたことに、5×10 ⁶ のとき CCRF-CEMセルを追加すると、消光した蛍光は時間内に回復することができました（図2a、曲線c）。それにもかかわらず、CCRF-CEM細胞を追加した場合、GOコンジュゲーションなしのFAM-aptの蛍光強度に明らかな変化はありません（図2a、曲線d）。 CCRF-CEMは非蛍光セルです（図2a、曲線e）。したがって、蛍光の回復は、主にグラフェンの表面からのアプタマーの解離と蛍光基の露出によるものです。蛍光消光と回復のこれらの実験は、CCRF-CEM-アプタマー複合体（CEM-apt）がFAM-aptがGOによって消光されるのを防ぐことができ、CEMはGOよりもそのアプタマーに対して強い結合親和性を持っていることを明確に示しています。一本鎖アプタマーとCEM-アプタマー複合体の構造の違いのおかげで、GO表面のアプタマーはCEMと相互作用し、CEM-アプタマー複合体に変換することができます。この現象はまた、CEM-アプタマー複合体のアプタマーへの結合がGOの結合よりも弱いことを明確に示しており、したがって、アプタマーがGOの表面から落下することを可能にしている。 FAM-aptはGO表面から離れた位置にあり、エネルギー伝達効率が低下するため、蛍光が回復します。 FAM標識Sgc8アプタマーとCCRF-CEMの蛍光発光スペクトルの統計分析は、さまざまな条件で実行されました（図2b）。

CEMセルのGo-apt検出の実現可能性。 a さまざまな条件でのFAM-aptおよびCCRF-CEMセルの蛍光発光スペクトル：（a）FAM-apt、（b）FAM-apt + GO、（c）FAM-apt + GO + CCFF-CEM、（d）FAM- apt + CCFF-CEM、および（e）CCRF-CEM; FAM-apt（20 nM）; GO（25μg/ mL）; CCRF-CEM（1×10 ⁶ セル）。励起490nm。 b 異なる条件でのFAM-aptおよびCCRF-CEMの蛍光発光スペクトルの統計分析。 NSは重要ではありません。 **** P <0.0001

GO-apt蛍光アプタセンサーの特性評価

設計を検証するために、均一で分散化されたGOが取得されました。図3aから、厚さ1.17 nmのGOシートは、AFMによる典型的な2次元の外観を持っていることがわかります。ただし、1.94 nmの厚さのGO-aptは、FAM-aptがGO表面に正常に吸収されたことを示しています。 FAM-aptとGOのゼータ電位はそれぞれ-11.35と-23.90mVでしたが、GOがFAM-aptと非共有的に相互作用すると、ゼータ電位の絶対値が増加しました（図3b）。これらの結果は、アプタセンサーが正常に構築されたことを示しています。図3cから、GOは234 nmで強い吸収を示したことがわかります。これは、πに起因します。 -π *芳香族C =C結合の遷移。 FAM-aptは、DNA配列（260 nm）とFAM（503 nm）の吸収帯を特徴としますが、FAM-aptの溶液にGOを添加すると、赤方偏移が発生し、503nmでのFAMの吸光度が増加します。考えられる理由は、FAM-aptがGO表面に吸着されていることであり、2つのπ間の電子的相互作用を示しています。 GOのシステムと基底状態の染料。したがって、結果はGO-aptが正常に構築されたことを示しています。

GO-aptの特性評価。 a GOおよびCEM-aptのAFM画像。 b FAM-apt、GO、およびCEM-aptの表面ゼータ電位。エラーバーは±SD（ n =3）。 c （a）GO、（b）FAM-apt、および（c）GO-apt

のUV-可視吸収スペクトル

細胞の蛍光顕微鏡

細胞レベルでのFAM-apt結合の特異性を直接視覚化するために、CCRF-CEMおよびRamos細胞をGo-aptとインキュベートし、蛍光顕微鏡を使用して分析しました。蛍光スペクトル実験と一致して、FAM-aptはGo-aptから落下し、蛍光染色のためにCCRF-CEM細胞に結合できますが、Ramos細胞には結合できません（図4）。

GO-aptと混合した後のCCRF-CEMおよびRamos細胞の蛍光顕微鏡写真。核はDAPIで染色されました。スケールバーは25μmを示します

CCRF-CEMの検出のための実験条件の最適化

蛍光アプタセンサーの優れた性能を得るために、蛍光の消光と回復の時間を最適化しました。 FAM-aptとGO、およびCCRF-CEM細胞を含む均一なGO溶液中のFAM-aptの速度論的挙動を、消光と回復時間の関数として蛍光強度をモニターすることによって調査しました（図5a、b）。図5aに示すように、GOの存在下でのインキュベーション時間の関数としてのFAM-aptの蛍光消光を観察できます。 FAM-aptはGOの表面に急速に吸着し、その後エネルギー伝達を受けます。同時に、蛍光強度は大幅に低下し、2分後に遅くなる傾向があります。対照的に、CEM-aptが形成され、GO表面からの放出が遅くなります。インキュベーション時間が30分を超えると、蛍光強度がプラットフォームに到達しました（図5b）。これらの時間依存実験は、GOが優れた消光剤として、FAMに適した蛍光を急速に消光し、CEMの存在下で徐々に蛍光を回復することを示しています。

実験条件の最適化。 a 時間の関数としてのGOによるTris-HClバッファー中のFAM-apt（20 nM）の蛍光消光。 b CCRF-CEMによるGO溶液中のFAM-aptの蛍光回復（1×10 ⁶ ）時間の関数として。 c 1×10 ⁶ の非存在下（曲線a）および存在下（曲線b）でのFAM-aptの蛍光強度に対するGO濃度の影響 CCRF-CEMセル。 d 蛍光強度率（ F / F ₀ ）FAM-apt by1×10 ⁶ GO濃度の関数としてのCCRF-CEMセル。励起490nm

蛍光アプタセンサーをCCRF-CEMの検出に対してより感度の高いものにするために、GO濃度を最適化するために使用される反応システムが不可欠になります。図5cは、私たちの戦略を明確に示しており、CCRFの非存在下（図5c、曲線a）と存在下（図5c、曲線b）でのFAM-aptの蛍光強度に対するさまざまな濃度のGOの影響を示しています。 -CEM。図5cからわかるように、GOを追加すると、蛍光シグナルのバックグラウンドが大幅に減少します。図5dは、1×10 ⁶ によるFAM-aptの復元された蛍光を示しています。 GO濃度の関数としてのCEMセル。図5dから、GO濃度が20μg/ mLの場合、 F の比率がわかります。 / F ₀ （ここで F ₀ および F CCRF-CEMの非存在下と存在下での518nmでのFAMの蛍光強度は、それぞれ13.0354である最高値を取得します。したがって、20μg/ mLが最適なGO濃度であると見なされました。

GO-apt蛍光アプタセンサーによるCCRF-CEM検出

良好な実験結果を得るために、最適な実験条件を使用してCCRF-CEMを検出しました。図6aは、CCRF-CEMの数が0から1×10 ⁷ に増加することを示しています。 、それに応じて蛍光強度も増加します。さらに、 F / F ₀ は、1×10 ² の範囲でCCRF-CEMの数に明確な線形依存性を示しています。 –1×10 ⁷ （図6b）。線形回帰方程式は Y です。 （ F / F ₀ ）=3.2608×log C − 5.1892（ C はCCRF-CEMの数です）回帰係数 R ² =0.9922。検出限界は10セル未満とみなされます。したがって、GOベースの蛍光アプタマーセンシングは検出範囲が広く、CCRF-CEMを検出するための理想的なバイオセンサーとして使用できます。他の方法と比較して、この方法は感度が高くなります（表1）[34,35,36,37,38,39]。

CEMセルのGo-apt検出。 a 異なる濃度のCCRF-CEM細胞の存在下でのGO-apt蛍光アプタセンサーの蛍光発光スペクトル。 b 蛍光強度率（ F ）間の線形関係 / F ₀ ）およびCCRF-CEM細胞の濃度

GO-apt蛍光アプタセンサーの特異性

GO-apt蛍光アダプターの特異性を調査するために、Ramosセル、H22セル、293Tセルなど、いくつかの異なるセルを使用してシステムをテストしました。 100μLの各反応システムには、1×10 ⁶ が含まれていました。 細胞。図7は、CCRF-CEMが他のコントロールグループよりも高い蛍光強度を取得することを示しています。結果はまた、設計された蛍光アプタセンサーが非常に特異的であることを採用していることを明確に示しました。

CEMに対する蛍光アプタセンサーの特異性。蛍光強度率（ F / F ₀ ）CEM細胞、Ramos細胞、H22細胞、および293T細胞の存在下でのGO-apt蛍光アプタセンサーのそれぞれ（1×10 ⁶ ）、ここで F ₀ および F は、518nmでの検出セルがある場合とない場合の蛍光強度です。励起490nm

結論

CCRF-CEM細胞を検出するための便利で低コストで高感度の蛍光アプタセンサーを開発しました。この戦略では、πによる非共有結合の相互作用を巧みに使用します。 -π グラフェンと一本鎖DNAの間のスタッキング、およびグラフェン消光蛍光の優れた性能。アプタマーと比較して、CEM-アプタマー複合体のGOへの結合が弱いため、グラフェンによって消光された蛍光を徐々に回復させることができます。最適化された条件下では、検出限界は100セル未満と見なされます。したがって、その優れた性能に基づいて、蛍光アプタセンサーは腫瘍細胞の検出において幅広い展望を持っています。

変更履歴

略語

AFM：

原子間力顕微鏡

CEM-apt：

CCRF-CEM-アプタマー複合体

FAM-apt：

FAM標識Sgc8アプタマー

FRET：

蛍光共鳴エネルギー移動

GO：

酸化グラフェン

GO-apt：

酸化グラフェン-アプタマー錯体

PBS：

リン酸緩衝生理食塩水