Punicagranatumの皮抽出物から合成された銀ナノ粒子の抗菌および細胞毒性効果

背景

サイズが100nm未満のナノ粒子はドラッグデリバリーや生物医学的応用に理想的な薬剤であるため、過去数十年で、特にナノ粒子のグリーン合成と特性評価を含むナノテクノロジーに関する研究が増えています[1]。ナノ粒子の合成は、ナノテクノロジー、バイオテクノロジー、化学処理、物理的方法論、システムエンジニアリング、分子モーター、ナノクリスタル、ナノバイオマテリアルなど、いくつかの分野で影響力のある役割を果たしています[2]。今日、ナノ粒子の製造には3つの方法があります。化学的、物理的、および「グリーン」ルートであり、グリーンルートには植物抽出物や微生物ろ液などの生物学的還元剤の使用が含まれます。最初の2つの方法はコストがかかり、有毒な副産物を生成することがよくありますが、グリーンナノシンセシス法は、安価で環境に優しいプロセスとして認識されています[3,4,5]。

NPのグリーン合成では、タンパク質、酵素、炭水化物などの植物成分を使用して、標的生体分子と容易に相互作用できるナノ粒子を配合します[6]。銀ナノ粒子の合成へのこのアプローチは、植物ナノテクノロジーによって制御できるさまざまな形態の癌または他の病気の将来の治療において重要な役割を果たす可能性があります[7、8]。 Escherichia coli などのグラム陰性菌 、緑膿菌 、および Proteus vulgaris 、および黄色ブドウ球菌などのグラム陽性病原菌 および S。表皮ブドウ球菌 、院内感染のほとんどに関与しています[9]。確かに、肺炎や血流感染症を含む外科的感染症も、グラム陽性菌とグラム陰性菌の存在によるものです[10]。植物を介したAgNPの合成は、公衆衛生に関連する微生物病原体に対する効果的な抗菌剤の開発に役立ちます。最近、合成されたAgNPが抗生物質レボフロキサシンと相乗的な関係を持ち、総抗菌活性を高めることが注目されています[11]。多くの研究者は、合成されたAgNPには、グラム陽性菌とグラム陰性菌に対するよく知られた抗菌特性と、さまざまな癌性および正常細胞株に対する細胞毒性効果が含まれていると報告しています[12、13、14]。さらに、AgNPは、表面積対体積比が高いため非常に効率的であり、銀イオンのみと比較した場合、容易に破壊され、細菌細胞に浸透する能力があります[13]。

現在の研究は、 Punica granatum の水性抽出物を使用したAgNPのグリーン合成に焦点を当てています。 皮をむき、ストリークプレートを使用して抗菌特性を調査し、37°C​​で24時間培養した後の最小発育阻止濃度（MIC）を測定します。グラム陰性菌 E。コリ （ATCC 25922）、 P。緑膿菌 （ATCC 27584）、 P。尋常性 （ATCC 8427）、および Salmonella typhi （ATCC 14028）およびグラム陽性菌黄色ブドウ球菌 （ATCC 29213）、 S。表皮ブドウ球菌 （MTCC 3615）、および K。肺炎 合成されたAgNPによる潜在的な成長阻害をテストするために研究されました。さらに、結腸癌細胞株（RKO：ATCC®CRL-2577™）に対する細胞毒性効果がテストされ、12.5μgのAgNPの用量で3日目に56％、5日目に61％の細胞生存率を示しました。

メソッド

皮抽出物の調製

1キログラムのサウジザクロの果実（ Punica granatum —サウジアラビア王国のタイフ地方で栽培されている）は、サウジアラビアのリヤドにあるスーパーマーケットから購入しました。果実を水道水で数回洗浄した後、再蒸留水（DDH ₂ ）で洗浄しました。 O）。洗浄後、皮を注意深く取り除いた。ザクロの皮をDDH ₂ で完全にすすいだ O表面の汚染を避け、室温で完全に乾燥させます。最後に、皮は細かい力に粉砕されました。 10グラムの微粉末を100mLのDDH ₂ に浸しました。 室温で24時間O。得られた混合物をワットマンNo.1濾紙を使用して濾過し、水性抽出物を得た。プロセス全体は滅菌状態で実行されました。

AgNPの合成プロセス

硝酸銀（AgNO ₃ ; 0.1 mM）を250mLのDDH2Oと混合しました。次に、10ミリリットルのザクロの皮の水性抽出物を加え、振とうインキュベーターを使用して5分間溶液を完全に混合しました。反応混合物は、24時間後に無色の溶液から茶色の溶液に色が変化することがわかりました。これは、銀イオンが銀ナノ粒子に還元されたことを示しています。次に、ナノ粒子溶液を15,000 RPMで15分間遠心分離し、このプロセスを4回繰り返しました。最後に、精製されたAgNPが収集され、合成されたNPの特性と生物活性を分析するためにさらにアッセイが実行されました。余分な皮の抽出物は、さらに分析するために4°Cで保存しました。

AgNPの特性評価

ザクロの皮の水性抽出物による銀イオンの還元は、反応開始から24、48、72時間後にPerkin Elmer Lambda 950 UV / Vis / NIR分光光度計を使用して、200〜800nmの分解能で1nmの分解能でモニターしました。 。 XRDパターンは、2 θで20〜50の範囲のスキャン速度が可能なPANalyticalX線回折計によって取得されました。 銀ナノ粒子の結晶構造を決定するために使用されました。

AgNPの表面トポグラフィーおよび組成分析は、JEOL JEM-1230（JEOL、東京、日本）およびJSM 6380 LASEMで実行されたTEM分析を使用して3.0nmの解像度で実行されました。 AgNPの元素分析は、JED 2200シリーズ（Jeol）を使用したエネルギー分散型X線分光法（EDX）によって実行されました。

抗菌研究

細菌懸濁液の準備

細菌株 E。コリ （ATCC 25922）、 P。緑膿菌 （ATCC 27584）、 P。尋常性 （ATCC 8427）、 S。腸チフス （ATCC 14028）、 S。アウレウス （ATCC 29213）、 S。表皮ブドウ球菌 （MTCC 3615）、および K。肺炎 サウジアラビア王国リヤドのキングハリド病院から入手した。細菌細胞の迅速な同定は、以前に公開された方法[15]に従って実行されました。同定されたすべての培養物を寒天培地に移し、研究に必要になるまで-20°Cで保存しました。その時点で、各細菌株を滅菌普通寒天培地に接種し、37°C​​で24時間培養しました。サスペンション（10 ⁶ CFU / mL）は、24時間培養した培養液から5 mLの栄養ブロスに接種物のループを移し、37°C​​で2時間培養することによって調製しました。

抗菌アッセイ

抗菌活性アッセイは、寒天ウェル拡散法を使用して実施されました[16]。滅菌綿棒を新鮮な細菌懸濁液で湿らせ、固体の滅菌ミューラーヒントン寒天プレートに広げた。コルクボーラーを使用して寒天プレートにウェルを作成した。さまざまな濃度（25、50、75、および100μL）の合成ナノ粒子懸濁液を各連続ウェルに注ぎました。すべてのプレートを37°Cで24時間インキュベートしました。培養したすべてのプレートの各ウェルの周囲の阻害ゾーンを測定しました（mm）。実験ごとに、3回の繰り返しが行われました[17]。

細胞増殖分析

細胞増殖に対するAgNPの効果は、以前に説明されているようにAlamarBlueアッセイを使用して評価されました[12]。

簡単に言うと、0.005×10 ⁶ 細胞/ウェルをさまざまな濃度（100〜0.3μg / mL）のAgNPを含む96ウェルプレートに播種し、37°C​​で2〜5日間インキュベートしました。培地DMEMには、4500 mg / L d-グルコース、4 mM l-グルタミン、110 mg / Lピルビン酸ナトリウム、10％ウシ胎児血清（FBS）、1×ペニシリン-ストレプトマイシン、および非必須アミノ酸が追加されました。 （すべてGibco-Invitrogen、USAから購入）。コントロールウェルを培地のみで処理し、3日目と5日目に細胞増殖を測定しました。これらの時点で、アラマーブルー（1:10）を各ウェルに添加し、プレートを37°Cで4時間インキュベートしました。;次に、分光光度マイクロプレートリーダー（Biotek Synergy 2; Biotek Instruments、USA）を使用してプレートを読み取り、相対蛍光ユニット（RFU）を記録しました。

細胞アポトーシス/壊死分析

アポトーシス/壊死を測定するために、細胞をさまざまな濃度（25〜1.5μg / mL）のAgNPで処理しました。 5日目に、100μg/ mLのAO（アクリジンオレンジ）と100μg/ mLのEtBr（臭化エチジウム）（AO / EtBr、Sigma、ミズーリ州セントルイス）を含む二重蛍光染色液（1μL）で細胞を染色しました。 ）。染色した細胞をAO / EtBr（1：100）色素溶液に1分間曝露し、Nikon EclipseTi蛍光顕微鏡を使用して観察しました。結果を実験対照と比較した。 2つの色素の組み合わせであるAO / EtBrは、異常なクロマチン組織を持つ細胞を視覚化するのに役立ちます。 AO / EtBrの取り込みの違いにより、生細胞と非生細胞の識別が可能になります。特に、AOはアポトーシスを起こした細胞の数を視覚化するために使用されました。

統計分析

統計分析とグラフ化は、Microsoft Excel2010とGraphPadPrism 6.0ソフトウェア（GraphPad、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して実行されました。 P 値は、一元配置分散分析の多重比較を使用して計算されました。さまざまな濃度の抗菌データ分析は、有意水準 P でテストされました。 <0.05。

結果と考察

AgNPは、還元剤源としてザクロの皮の水性抽出物を使用して首尾よく合成されました。図1aは、250mLのDDH ₂ に溶解した0.1mMの硝酸銀を示しています。 O無色の溶液を作る。次に、10 mLの水性皮抽出物を加えてよく混合すると、図1bに示すように、反応混合物は24時間かけてゆっくりと暗褐色に変化しました。 AgNPの合成中に観察された色の変化は、葉、花、皮、種子、果物などのいくつかの種類の植物部分抽出物を使用した場合の同様の反応で報告されています。色の変化はAgNO ₃ によるものでした 植物源と相互作用し、硝酸銀から元素銀に還元されます[18、19、20、21、22]。

a 0.1mMの硝酸銀。 b P後に色が変わります。グラナタム ピールエキス添加

図2は、ザクロの皮の水性抽出物を使用して合成されたAgNPのUV-Visスペクトルを示しています。図2に示すように、吸収帯は、反応時間24、48、72時間で378 nmにピークがあり、強度はそれぞれ0.96、1.08、1.16です。反応が発生する時間が長くなるにつれて、強度は時間とともに増加し、AgNPの濃度が高くなりました。表面プラズモン共鳴データは、AgNPの濃度の増加がAgNPピークの増加につながり、時間の経過とともに減少した銀の量の増加と一致することを示しました。 AgNO ₃ として ザクロ抽出物からの電子の放出によりAgNPを形成するために反応し、同時反応がアスコルビン酸ラジカルを酸化し始めました。同様のUV-Vis吸収スペクトルが、ザクロの皮の抽出物からAgNPを生成した別の研究で観察され、371nmに吸光度のピークがありました[23]。

時間間隔で48〜72時間で合成されたAgNPのUV-Vis吸光度スペクトル

緑で合成されたAgNPのXRDパターンを図3に示します。2θに6つの強い回折ピークが観察されます。 0から90の範囲の値は、中央のAgイオンを持つ面体の立方体の111、200、220、および311平面を割り当てることができることを示します。 XRDスペクトルは、合成されたAgNPが結晶構造に形成されたことを示唆しています。この結果は、以前にJCPDSデータベース（No. 04-0783）で公開されたXRDパターンと一致しています。観察された未確認の結晶ピーク（*）は、酸化銀に対応します[24]。 0.1 mMザクロ水性ピールNPのTEM画像を図4に示します。この画像は、粒子が直径20〜40 nmの球形であり、平均粒子サイズが26.95nmであることを示しています。 Actinidia deliciosa を使用したNPのナノ合成に関しても同様の報告があります。 フルーツエキス[25]。合成されたAgNPのSEM観察（図5）は、ザクロの皮の細胞の表面に銀ナノ粒子が均等に分布していることを示しています。この画像から、ナノ粒子は球形であり、直径は20〜40 nmであると判断されました。これは、 Raphanus sativusを使用して生成された直径34〜50nmの球形のAgNPに関する以前の報告と同様です。 L.ピールエキス[26]。

Pから合成されたAgNPのXRDパターン。グラナタム ピールエキス

Pから合成されたAgNPのTEM画像。グラナタム ピールエキス

Pから合成されたAgNPのSEM画像。グラナタム ピールエキス

ここで紹介するザクロの皮の抽出物を使用した銀ナノ粒子の植物合成では、得られたナノ粒子のサイズはドラッグデリバリーに非常に有望です。 100 nm未満のナノ粒子のサイズは、スマートシステムの開発に役割を果たし、治療およびイメージングの価値と特定の組織への薬物送達を強化して、徐放性治療を提供すると報告されています[27]。ナノ粒子のサイズと形状は、標的組織における薬物の生物学的利用能に影響を与えます。 100 nmのナノ粒子は、直径1μmの粒子の場合と比較して2.5倍の取り込みを示すことが報告されています[28、29]。ナノ粒子のサイズは、分解、血管動態、ターゲティング、クリアランス、取り込みメカニズムなどの粒子機能において重要な役割を果たします[30]。さらに、合成されたAgNPのナノ結晶性は、報告されているように生体内分布と薬物動態を改善します[31、32]。以前に報告されたように、ザクロのバイオ廃棄物の利用は、廃棄物の利用に向けた新しいアプローチになるでしょう[33]。

EDX研究のデータは、図6に示すように、合成されたナノ粒子に含まれる元素の定性的および定量的分析を提供しました。EDX研究は、合成されたNPの含有量の元素内訳を提供し、NPは70％で構成されていると推定しました。重量によるAg。結果で特定された他の元素と結合には、C-K、O、C-U、Cu、およびKが含まれ、それぞれが総質量のわずかなパーセンテージに対応していました。 EDXレポートは、0.1 mM AgNO ₃ の低濃度であるという証拠を提供します。 合成されたAgNPの数が多くなりました。 0.3 mM AgNO ₃ でも同様の結果が報告されました これを蒸留水に3時間注ぎ、300°Cに加熱し、ザクロの皮の抽出物1、2、3gを30mLの蒸留水と混合して80°Cに加熱しました[34]。

Pから合成されたAgNPのEDX画像。グラナタム 定量分析による皮むき抽出物

ザクロで合成されたAgNPの抗菌特性は、25、50、75、および100μg/ mLのサンプルを使用して、寒天ウェル拡散試験によりグラム陽性菌とグラム陰性菌の両方に対して調査されました。グラム陰性菌を含む寒天プレート E。コリ 、 S。腸チフス 、およびP. aeruginosa 抑制ゾーンを図7a–cに示します。低濃度のザクロ合成AgNP（25および50μL）は、 Pに対して阻害活性を示しました。緑膿菌 および E。コリ ただし、 Sに対してではありません。腸チフス。 ザクロ製品の同様の抗菌効果が以前に報告されており、 Eで最も強い阻害が観察された。コリ 、 S。アウレウス 、および P。緑膿菌 [35,36,37]。

グラム陰性病原菌のAgNPの抗菌効果と阻害ゾーン（ a – c ）

グラム陽性病原菌のAgNPの抗菌効果と阻害ゾーン（ d – f ）

図8a–cは、グラム陽性病原菌 Kに対する合成AgNPの抗菌活性を示しています。肺炎 、 S。アウレウス 、および S。表皮ブドウ球菌 。 Kでは、AgNP濃度が低い場合（25および50μL）でも抗菌活性が観察されました。肺炎、 それぞれ9nmと14nmの抑制ゾーンを持ち、 Sに対して。アウレウス 、それぞれ6nmと14nmの抑制ゾーンを持ちます。初期の研究では、合成されたNPで処理されたグラム陽性菌の増殖阻害も確認されました[35、36、37、38]。合成されたAgNPへの曝露後に評価された抗菌活性は、7〜21mmの範囲の阻害ゾーンを示しました。図9は、さまざまな濃度（25〜100μL）の Pの抑制効果を示しています。グラナタム EでAgNPをはがします。コリ 、 P。緑膿菌 、 S。腸チフス 、 K。肺炎 、 S。アウレウス 、および S。表皮ブドウ球菌 。低濃度のAgNPでも、 Sを除くすべての微生物で良好な抗菌活性が観察されました。腸チフス 、以前に報告されたように[38]。

AgNPの細胞毒性効果を分析するために、結腸癌細胞株（RKO：ATCC®CRL-2577™）を利用しました。 3日目には、12.5μgの処理で56％の生存率、5日目に61％の生存率が見られました。増殖の全体的な有意な減少は、>12.5μgで観察され（図10a）、 5日目。さらに、AO / EtBr染色画像は​​、コロニーと細胞数を視覚化することで増殖の低下を確認しました（図10b）。興味深いことに、12.5μgで核周囲の細胞質液胞を持つ細胞を観察することができました（図10b、c）。このプロセスは、プログラム細胞死を促進するためのオートファジーのプロセスにおけるリソソームの分解経路である可能性があります。ただし、オートファジー機能に対するAgNPの効果を確認するには、さらなる研究が必要です。 Pimpinella anisum を使用して合成されたAgNPに関する以前の研究では また、12μgのAgNPは、アポトーシスまたは壊死のいずれかを増強することにより、HCT116細胞に対して毒性があることもわかりました[12]。低濃度のAgNPもアポトーシスを誘導できることが報告されています[39]。 Punica granatum で合成されたAgNPを使用した現在の実験 皮抽出物も12.5μgで55〜62％の毒性を示しました。さらに、AO / EtBr染色により、オートファジーによるプログラム細胞死の鮮明な画像が明らかになりました。

グラム陰性およびグラム陽性病原菌に対するAgNPの抗菌活性

AgNPの細胞毒性。 a RKO細胞の細胞増殖と生存率の分析。一元配置分散分析の多重比較、*** P <0.0005。 b RKO細胞のアポトーシス/壊死分析。 c 異なる用量のAgNPに曝露されたRKO細胞

結論

本研究の結果は、ザクロの皮の抽出物が、20〜40 nm（平均サイズ、26.95 nm）のサイズ範囲の銀ナノ粒子を合成するための優れた還元剤であることを示しました。ターゲットサイト。低濃度のAgNP（25〜100μL）でも、テストされた生物に対する合成AgNPの抗菌活性は、グラム陰性菌およびグラム陰性菌に対する治療用の新規抗菌剤の開発のためのグリーン合成AgNPの抗生物質効率をさらに確認します。 -陽性病原菌。さらに、結腸癌細胞株に対するAgNPの観察された細胞毒性効果、および>12.5μgの用量レベルでの細胞増殖の減少は、腫瘍の第一選択治療としてAgNPをさらに促進します。

略語

EDX：

エネルギー分散型X線分光法

SEM：

走査型電子顕微鏡

TEM：

透過型電子顕微鏡

XRD：

X線回折