標的化送達のためのpH（低）挿入ペプチド（pHLIP）によるナノベシクルの装飾

はじめに

約1世紀前、Paul Ehrlichは、「魔法の弾丸」を実現するというアイデアを浮かび上がらせ、特定のより効果的な薬物の送達を実現しました[1]。 「魔法の弾丸」は、過酷な環境から送達された薬物を保護し、薬物を病変組織に標的化し、薬物の薬物動態および薬力学を改善し、薬物放出を調節することによって副作用を減らすことができるはずです[2]。

1965年、バンガムはリン脂質ベースの小胞を初めて観察し[3]、その後、グレゴリーグレゴリアディスは、リポソームが薬物をカプセル化し、薬物送達システムとして使用できるという概念を確立しました。特に、それらはリン脂質の閉じた二重層（ラメラ）で構成されており、疎水性の脂質鎖が2つの親水性のヘッドグループ層の間で閉じられています。閉じた二重層は水性コアを取り囲んでいるため、親油性または親水性の薬物をそれぞれ局在化させることができます[4、5]。

リポソームのサイズは、血漿タンパク質の吸収、細網内皮系（RES）による認識、循環半減期、および細胞輸送の観点から、投与後のキャリアの運命に影響を与える重要なパラメーターです。ナノサイズの担体は細胞の内在化と腫瘍の標的化を促進する可能性があるため、多くの研究者が「ナノ化」に焦点を当てています[6,7,8,9]。

より用途が広く、より経済的なナノキャリアを得るために、合成界面活性剤を使用して、リポソーム様の薬物送達システムを得てきた。非イオン性界面活性剤はこの目的で広く使用されており、自己組織化して単層または多層の小胞になります（非 -イオン性リポソーム 、ニオソーム、または非イオン性界面活性剤ベシクル）。ソルビタンエステル界面活性剤（Spans®）は、ニオソームの調製に広く使用されている親油性物質です。小胞の循環時間を延長し、「ステルス」ナノキャリアを得るために、ポリエチレングリコール（PEG）の組み込みはゴールドスタンダードのアプローチです。この結合により、エトキシエチル化ソルビタンエステル界面活性剤（Tweens®）が得られます。 SpanとTweenはどちらも、異なる親水性/親油性バランス（HLB）値を特徴とし、界面活性剤の選択により、目的の特性を持つニオソームを調製できます[10]。さらに、コレステロールの添加は、界面活性剤の尾を伸ばし、界面活性剤のゲルから液相への転移温度に影響を与え、親油性二重層の剛性を与えることにより、二重層の安定性を高めるために使用されます[11、12]。処方を改善し、および/またはターゲティングを強化するため[10]。

今日、癌は世界の主な死因の1つです。現在の治療アプローチには、腫瘍への非効率的な薬物送達や、望ましくない危険な副作用に関連する腫瘍ターゲティングの欠如など、多くの制限があります。これは、ナノテクノロジーアプローチが克服するのに役立つ可能性があります[13]。

現在、さまざまなターゲティングアプローチが開発されています。それらのほとんどは、癌細胞の表面で過剰発現している特定のバイオマーカーのターゲティングに基づいています。しかし、ヒトの腫瘍は非常に不均一であるという事実のために、腫瘍標的化のより一般的なアプローチははるかに有利です。癌細胞の表面の酸性度は腫瘍微小環境の特徴であり、腫瘍灌流に依存しないため、腫瘍細胞を標的とするための一般的なバイオマーカーとして役立つ可能性があります[14]。 pH（低）挿入ペプチド（pHLIP）技術は、イメージングや治療用小分子、さらにはナノマテリアルを腫瘍に標的化するために急速に発展しています。 pHLIPは癌細胞の表面でpHを感知し、標的細胞の膜に挿入されます[15、16]。 pHLIPの挿入メカニズムは、低pH（pH <7.0）でのペプチドの負に帯電した残基のプロトン化によって引き起こされます。これにより、ペプチドの疎水性が高まり、平衡がペプチドの二重層への分配にシフトします[17]。 pHLIPで装飾されたナノキャリアは生体適合性があり、腫瘍を標的とすることができ、癌細胞による細胞取り込みの増強を示します。調査されたpHLIPコーティングされたナノ粒子の中には、脂質、ポリマー、および金属ベースのナノ材料があります[18、19、20、21]。

本研究の目的は、ナノキャリアの特徴に関する基本的な理解を得て、酸性度に敏感なナノベクターの合理的な設計を容易にするために、pHLIPによって装飾された新規の小胞ナノキャリアを完全に特徴づけることです。

材料と方法

資料

ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Tween 20）、ソルビタンモノラウレート（Span 20）、コレステロール（Chol）、Hepes塩{ N -（2-イドロキシエチル）ピペラジン- N ' -（2-エタンスルホン酸）}、ヒト血清、Sephadex G-75、カルセイン、およびジフェニルヘキサトリエン（DPH）は、Sigma-Aldrichから購入しました。 1,2-ジミリストイル- sn -グリセロ-3-ホスホコリン（DMPC）および1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン- N -[4-（p-マレイミドフェニル）ブチルアミド]ナトリウム塩（DSPE-マレイミド）はAvanti Polar Lipidsから購入し、ピレンはFlukaから入手しました。 pHLIPペプチド（ACEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGT）は、CSBioによって合成および精製されました。他のすべての製品と試薬は分析グレードのものでした。

DSPE-pHLIPの合成

pHLIPは、前述のように、DSPE-マレイミドとpHLIPのN末端の単一システイン残基との共有結合によってメタノール中のDSPE脂質と結合しました[18、21、22]。簡単に説明すると、250μLのメタノール（アルゴンでブロー）に溶解した5 mgのペプチドとクロロホルムに溶解したDSPE-マレイミド（9.9 mMストック溶液から）を1：1のモル比で混合しました。結合が完了するまで、反応混合物を室温で約2〜6時間維持しました。 DSPE-マレミドとpHLIPの結合における反応の進行は、反応混合物中の非標識pHLIPに対応するピークの減少を監視することにより、0.05％TFAを含む水中の25〜80％アセトニトリルの勾配を使用するRP-HPLCによって監視されました。合成されたコンストラクトは、SELDI-TOF質量分析によって特徴づけられました。 DSPE-pHLIPコンジュゲートの濃度は、pHLIPのモル吸光係数を使用した吸光度によって決定されました：ε ₂₈₀ =13,940M ^-1 cm ^-1 。

ベシクルの準備と精製

薄層蒸発法を使用して、非イオン性界面活性剤（Tween20またはSpan20から）およびリン脂質（DMPCから）ベシクルを、pHLIPの有無にかかわらず調製しました。各ベシクル製剤に、コレステロールを異なるモル比で添加しました（表1）[23]。

サンプルの組成は、同じ量のpHLIPが追加された以前によく特徴付けられた構造[24、25]を選択して最適化されています。

親油性成分は最初にCHCl ₃ に溶解されました ：CH ₃ OH混合物（3：1）;次に、サンプルに応じて異なる温度で真空下で有機溶媒を除去しました。得られたフィルムを5mLのHepesバッファー（0.01 M pH 7.4）またはカルセインナトリウム溶液10 ^-2 で水和しました。 M.懸濁液を約5分間ボルテックス混合した後、20 kHzで動作するマイクロプローブ（VibraCell-VCX 400-Sonics、米国マサチューセッツ州トーントン）を使用して超音波処理（追加ファイル1：表S1、サポート情報を参照）しました。 LipoDMPC超音波処理は、酸化を防ぐために不活性雰囲気下で実施されました。

次に、小胞懸濁液を、Sephadex G-75（50×1.2cmのガラスカラム）および溶離液としてHepesバッファーを使用するゲル浸透クロマトグラフィーによって精製した。その後、精製された小胞懸濁液は、適切な孔径のセルロースフィルターによってろ過されました。

同じ調製方法を使用して、pHLIPでコーティングされたニオソームおよびリポソームを調製した。

動的光散乱測定

小胞の平均サイズとサイズ分布は、 T で測定されました。 =25°C動的光散乱（DLS）、5 mW HeNeレーザー（波長λ=632.8nm）とデジタル相関器を備えたMalvern NanoZetaSizerZS90を使用。 90°の角度での散乱強度の正規化された自己相関関数をContinアルゴリズムで分析して、粒子拡散係数 D の分布を取得しました。 したがって、有効流体力学的半径 R の分布 _H ストークス-アインシュタインの関係式 R による小胞の生成 _H = K _B T /6πη D 、ここで K _B T は熱エネルギー、ηは溶媒粘度です。ニオソーム/リポソームのサイズ分布の幅はかなり小さいですが、無視できません。表2に報告されている値は、粒子の強度加重平均流体力学的直径に対応しています[26]。

ζ-電位測定

電気泳動移動度測定は、Malvern NanoZetaSizer ZS90装置を使用して、レーザードップラー電気泳動技術によって実行されました。モビリティ u ζに変換されました -スモルコフスキーの関係ζ=uη/єを使用したポテンシャル。ここで、ηとєはそれぞれ溶媒相の粘度と誘電率です[27]。

小角X線散乱

小角X線散乱（SAXS）実験は、欧州シンクロトロン放射光施設（ESRF、グルノーブル、フランス）で実施されました。 ID02の高輝度ビームラインを使用することで、運動量伝達0.1 nm ^-1 の領域で希薄溶液の測定を実行できます。 ≤ q ≤6nm ^-1 、 q =（4π/λ）sin（θ/ 2）、ここで、θは散乱角、λ=0.1nmのX線波長です。対応する調査された長さスケールは1〜60 nmであり、ニオソームおよびリポソーム小胞の内部構造にアクセスするのに適しています。すべての実験は T で実施されました =25°C、短い照射時間、0.1秒、放射線による損傷を防ぎます。各サンプルについて、さまざまな散乱角度での散乱強度を2D検出器でキャプチャし、角度を付けて再グループ化し、バックグラウンドと溶媒の寄与を差し引いて分析し、溶液中の小胞の形状と内部構造に関する情報を取得しました。

単層ベシクルの場合、閉じた二重層は、外部ヘッドグループ、疎水性鎖、および内部ヘッドグループに対応する3つの同心シェルで​​モデル化されました。小胞サイズのシュルツ分布が仮定されました。

Cryo-TEM

小胞溶液（5μLの液滴）をレーシーフォーマー/カーボン電子顕微鏡グリッド上に広げ、液体エタンで急速凍結することにより凍結水和状態で保存しました。ガラス化プロセスは、FEI Vitrobotシステムを使用して、3秒のシングルブロット、1のオフセット、および1秒の排出および待機時間を設定して実行されました。小胞の画像化には、加速電圧200 kV、倍率×10,000〜×150,000の透過型電子顕微鏡（TEM）（JEOL 2100）を使用しました。

安定性研究

pHLIPの有無にかかわらず調製されたニオソームとリポソームの物理的安定性の研究は、2つの異なる保管温度（25°Cと4°C）で実施されました。目的は、小胞分散のサイズとζ電位に有意な変化が90日間にわたって発生するかどうかを評価することでした。各バッチからサンプルを一定の時間間隔（1、30、60、および90日）で採取し、小胞のサイズとゼータ電位を前述のように決定しました。

同様に、小胞の安定性は、ヒト血清などの体液の存在下でも調査された。懸濁液を37℃で45％のヒト血清と接触させた。一定の時間間隔（0、30分、1時間、2時間、および3時間）で、小胞サイズとゼータ電位の変動を説明したように決定しました。

二重層の特性評価

ニオソームおよびリポソーム二重層の流動性および微小粘度-極性は、二重層膜の疎水性領域にそれぞれ位置する2つの蛍光プローブ、ジフェニルヘキサトリエン（DPH）およびピレンの蛍光測定によってアクセスされました。小胞調製の前に、DPH（2 mM）とピレン（4 mM）の両方（それぞれ220μLと2.5 mg）を界面活性剤またはリン脂質/コレステロール混合物に添加しました[28]。その後、ピレンをロードしたベシクルを前述のように精製し、DPHをロードしたベシクルを徐々に小さい細孔サイズ（5.0から0.22μm）でろ過しました。

蛍光異方性測定は、LS55分光蛍光光度計（PerkinElmer、MA、USA）を使用して室温でλ _exc で実施しました。 =400nmおよびλ _em =425 nmおよび蛍光異方性（ A ）のサンプルは、次の式[29]に従って計算されました。

ここで私 _vv および私 _vh は、垂直に偏光された励起光の方向に平行および垂直に、それぞれ放出された蛍光（任意単位）の強度です。補正係数 G =I _hv / I _hh は、励起光が水平偏光されたときの垂直偏光と水平偏光の発光成分の比率です。蛍光異方性の値は、膜流動性に反比例します。したがって、高い蛍光異方性値は、高い構造秩序および/または低い膜流動性に対応します[30]。

小胞二重層の微小粘度と微小極性を評価するために、ピレンを用いた蛍光実験を、パーキンエルマーLS55分光蛍光光度計を使用してλ _exc で実施しました。 =330 nm、350 <λ _em の範囲の発光スペクトルを記録 <550 nm [28]。ピレン蛍光の微細構造は5つのピークを示します。ピレン蛍光スペクトルの1番目（372 nm）と3番目（382 nm）の振動バンドの強度の比率 I ₁ / 私 ₃ 、ピレン環境の極性に関連しています[31]。確かに、 I の値が低い ₁ / 私 ₃ 比率は無極性環境に対応します。さらに、小胞二重層に組み込まれたピレン分子は分子内エキシマーを形成する可能性があり、このプロセスはプローブ微小環境の粘度に敏感です[32]。したがって、エキシマー/モノマーの蛍光強度比 I _E / 私 _M 、微小粘度に関連しています。

これらの研究は、pHLIPの有無にかかわらず調製された小胞で実施され、得られた結果が比較されました。

カルセイン放出研究

非イオン性界面活性剤またはリン脂質小胞に、10 ^-2 の濃度のカルセインをロードしました。 M.この濃度では、カルセインの蛍光は自己消光します[33]。次に、デクエンチング測定を使用して、小胞の水性コアからのカルセイン放出を決定した。カルセイン水溶液5mLを添加することにより、薄膜の水和中に蛍光プローブを小胞にロードしました。小胞懸濁液をゲル浸透クロマトグラフィーで精製し、45％ヒト血清またはHepesと接触させた後、セルロース膜透析バッグ（Spectra /Por®のカットオフ分子量8.000Da）にロードしました。放出実験は、外部媒体としてHepesバッファー（10 mM、pH 7.4）中で磁気攪拌しながら、37°C​​で実施しました。外部培地のアリコートは、0〜24時間の異なる時間に回収されました。時々、回収されたアリコートがシステムに再導入されました[34]。

カルセインの放出は、λ _ex を備えたPerkin-ElmerLS50B分光蛍光光度計を使用して培地の蛍光を測定することによって監視されました。 =492およびλ _em =520nm。基準値 F _∞ （任意単位）は、小胞に捕捉された総カルセイン量と相関し[35]、イソプロピルアルコール（1：1 v ）を使用して小胞を破壊した後に決定されました。 / v ）。リリース率（ F ％）各時点で、次の式を使用して取得されました：

ここで F _t （任意単位）は、特定の時点で読み取られた蛍光です t 。

統計分析

一元配置分散分析を統計分析に使用しました。事後ボンフェローニ t ANOVA検定の統計的有意性を評価するために検定が実行されました。 p 値<0.05は統計的に有意であると見なされました。結果は、3回の実験の平均±標準偏差です。

結果と考察

DSPE-pHLIPの有無にかかわらず調製されたTween20-、Span20-、およびDMPC-ベシクルは、サイズとζ電位について特徴づけられました（表2）。

表2に示した結果によると、分析されたサンプルは、pHLIPの存在に関係なく、サイズまたはζ電位のいずれにも有意な変動を示していません。

上記の報告されたサイズ範囲は、クライオTEMなどの別の分析手法によって確認されました（図1）。

pHLIPでコーティングされたニオソームおよびリポソームの代表的なクライオTEM画像。 NioSpan20-pHLIPニオソームの画像（ a ）およびLipoDMPC-pHLIPリポソーム（ b ）×10,000倍率およびLipoDMPC-pHLIPリポソーム（ c ）で得られた ）×40,000倍率で得られた

DSPE-pHLIPがある場合とない場合のニオソーム/ベシクルの内部構造は、SAXS実験によって決定されました。図2に示されているSAXS強度スペクトルは異なり、各システムに固有の機能があることを示しています。

SAXSスペクトル。ニオソーム/ベシクルの強度スペクトル（黒の白抜きの記号）とDSPE-pHLIPあり（色の記号）

Tween20ベースのニオソームは単層ですが、DMPCベシクルは、 q に特徴的なピークが存在することからわかるように、ある程度の多層性を示します（リポソームとして）。 ≅1nm ^-1 、6 nmのラメラ間距離に対応します（約5nmの脂質二重層と1nmの水）。 Span20ベースのベシクルは間違いなくマルチラメラであり、 q に特徴的なピークがあります =1.6 nm ^-1 3.8 nmのラメラ間距離に対応し、Span20分子の長さの2倍に一致します。結果は、Span20ベシクルの多層シェルが隣接する二重層で構成されており、ラメラ間水がほとんどないことを示しています。

DSPE-pHLIP（1％モル分率未満）の存在は、システムに劇的な影響を与えません。調査したすべての q の散乱強度 -範囲は非常に似ており、構造化された材料の同等の割合と小胞粒子の同等の全体的なサイズを示しています。

DMPCベースのベシクルは、 q でのブラッグピークの強度の増加から推測できるように、リポソーム内の二重層の数のわずかな増加を示しています。 =1 nm ^-1 。各ペプチド分子にリンクされたDSPEC18鎖の低い部分の挿入は、脂質二重層の厚さを変更せず、主にDMPCに対するコレステロールの大きな部分（約40〜50％）によって決定されます。このコレステロール濃度では、脂質鎖は液体秩序（Lo）相で組織化され、鎖に沿った高い配向秩序に対する鎖の弱い横方向の位置秩序の分離を特徴とし、C18-をほとんどホストできません。構造変化のないチェーン[36]。また、Span20ベースの多層ベシクルは内部構造に変化を示しません。

Tween20 + pHLIPシステムでは、 q の典型的な鋭いピークで示されるように、少量のコレステロール微結晶が存在します。 =1.84nm ^-1 （3.41 nmの特徴的な距離）、そして小胞構造は影響を受けません。組成、調製手順、および精製に応じて、Tweenベースのニオソーム[37]に関連する微結晶がほとんど存在しないことがよくあります。図2に、Tween20およびTween20 + pHLIPベシクルの2つの実験スペクトルを、外部ヘッドグループ、チェーン、および内部ヘッドグループの3つの同心シェルで​​球状に閉じた二重層をモデル化して得られたフィッティング曲線とともに示します。小胞のフィッティング平均サイズは、DLSの結果と一致して、両方のシステムで約168nmです。構造パラメーターは、外部シェルを除いて、2つの閉じた二重層（追加ファイル1：図S1および表S2を参照）で同じです。DSPE-pHLIPの存在下では、ヘッドグループの電子密度がわずかに減少します（5％）。観察されます（0.42から0.40e /Å ³ ）、層の粗さの増加とともに。この結果は、DSPE-pHLIPの添加が主に小胞の外殻に影響を与えることを示しています。これは、DSPE C18鎖が二重層に挿入され、拡張および分岐したポリエチレングリコールヘッドグループの中でペプチドを小胞表面に固定する画像と一致しています。不飽和リン脂質二重層の場合、PHLIPペプチド自体（脂質分子にリンクされていない）が高pHで小胞の外面と相互作用し、低pHで二重層に挿入する能力が最近SAXSによって観察されたことに注意してください[38 ]。本研究では、pHLIPでコーティングされたpH感受性薬物ナノベクターを設計することが目標であるため、ペプチドのモル分率は大幅に低く、ペプチドは脂質に結合しています。 pHLIPの結合は、ナノベクターの疎水性領域に挿入された共役DSPEC18鎖の疎水性相互作用によって促進されます。 pHLIPペプチドは固定されており、外部ヘッドグループ領域にあり、酸性pHで標的膜と相互作用したり、低pH環境での二重層再配列後にナノベクター含有量を放出したりする傾向があります。

pHLIPの存在が二重層のマイクロレオロジー特性（流動性、微小粘度、および極性）に影響を与える可能性があるかどうかを調査するために、親油性シェルの特性評価を実施しました。特性評価研究は、調製手順の開始時にサンプルに追加された蛍光プローブピレンを使用して実施されました。親油性のため、小胞二重層に挿入され、膜環境の極性と微小粘度に関する情報を提供します。

表3に示すように、3つのサンプルセットすべてで、極性値はpHLIPなしの対応するベシクルと比較して、pHLIPの存在下でわずかに減少しますが、微小粘度値はすべてのベシクルで3倍の増加を示します。

二重層は、脂質に組み込まれた別の親油性蛍光プローブ、DPHの蛍光異方性の測定によってさらに特徴づけられました。これらの測定値は、プローブの動きと二重層内でのその配向を反映しており、小胞の内容物を放出する能力に影響を与える可能性のある二重層の流動性に関する情報を提供します[29]。蛍光異方性の値は、膜の流動性に反比例します。したがって、高い蛍光異方性値は、液体秩序相[30]のように、高い構造秩序および/または低い膜流動性に対応します。

各サンプルの異方性値を表3に示します。データは、蛍光異方性が減少したため、小胞内にDSPE-pHLIPが存在すると膜流動性が増加することを示しています。二重層の流動性は、無極性鎖の秩序と横方向の組織化だけでなく、極性のヘッドグループによっても影響を受けることはよく知られています[31]。 3つの異なるシステムでのSAXSの結果は、DSPE-pHLIP分子が主にヘッドグループ領域に影響を及ぼし、最終的に極性ヘッドの異なるパッキングを引き起こすことを示しています。構造的な結果は、2つの異なるプローブの挿入によって明らかにされたように、関連するDSPE-pHLIPの存在下での二重層のマイクロレオロジー特性と一致するようです。結果は、外側領域の近くに挿入できるプローブであるピレンによって明らかにされたように、微小粘度の増加を示しています（ピレンlog Pは4.88です）。一方、DPHは、脂質アシル鎖軸に平行に配向されているか、脂質二重層の中心に拘束されて、表面に平行に、二重層のコアに埋め込まれていると想定されます。これは、両親媒性アシル鎖の角度の再配向に大きく敏感です[39]。 DPHによって明らかにされたように、流動性の増加は、他のアシル鎖間のDSPE鎖の挿入の効果と、界面活性剤の充填特性を変化させる極性ヘッドグループ領域のpHLIPパーティションの効果の両方に関連している可能性があります。 （図3）。

小胞膜とのpHLIP相互作用の表現

検討された調製物について、さらなる特性化研究が実施された。 pHLIPの有無にかかわらず準備されたすべてのサンプルは、サイズとゼータ電位の変動を測定することにより、経時的な小胞の安定性を評価するために、4°Cの温度で90日間保存されました（追加ファイル1：図S2）。実験に沿って、サイズとζ電位に有意な変動は観察されませんでした。したがって、4°Cの温度で保存した場合、検査したすべての調製物は安定しました。

さらに、サンプルの安定性を90％（ v ）の存在下で調べました。 / v ）ヒト血清および37°Cで3時間保存（追加ファイル1：図S3）。

ヒト血清と接触すると、Tween20ベシクルはサイズの増加を示しましたが、300nm未満のままでした。サイズとPDI値は、3時間の実験で一定であると測定されました。これは、懸濁液中の小胞が実験全体で無傷のままであることを示唆しています。

ヒト血清と接触している両方のSpan20サンプルは、特にpHLIPを使用した調製でサイズの増加を示しましたが、PDI値は均一なサイズ分布を示しています（データは示していません）。このイベントは、静電相互作用の結果として、小胞の破壊を招くことなく、ニオソーム表面での血漿タンパク質の吸収が原因である可能性があります。この仮説は、小胞がヒト血清と接触した後のゼータ電位の低下によって裏付けられています。この現象は、中立領域付近でζ電位がわずかに負の値に達し、システムが不安定になり、小胞が凝集し始めるときに発生します。

Tween20と同様に、DMPCベシクルは接触前のサンプルと比較してサイズの増加を示します。ただし、この変動は重要ではなく、サイズ値は280 nm（DMPC）または240 nm（DMPC + pHLIP）未満に維持されていることが判明しました。

放出能力は、時間の経過とともに小胞から放出されたカルセイン（親水性プローブ）の量に続いて、pHLIPの有無にかかわらず調製されたサンプルについて評価されました。

研究は、HEPESバッファーまたはヒト血清のいずれかで精製サンプルを曝露することにより、37°C​​の温度で24時間実施されました。図4に示すように、カルセイン放出プロファイルは、HEPESバッファーまたはヒト血清中のTween20とTween20-pHLIPの両方で非常に類似していることがわかります。

カルセイン放出プロファイル。 NioTween20およびNioTween20-pHLIPがHEPESバッファーと接触しました（ a ）またはヒト血清（ b ）

カルセインの放出量は30〜50％であり、pHLIPを使用した場合と使用しない場合のサンプル間で放出能力に差がないことを示しています。

SpanサンプルとDMPCサンプルでも同じ結果が得られています（データは表示されていません）。

同等の放出プロファイルが、感熱性キュボソーム[40]や高分子自己組織化ナノキャリア（SAN）[41、42]などのさまざまな刺激応答性ナノキャリアについて報告されています。

結論として、DSPE-pHLIPの挿入の証拠によると、pHLIPの有無にかかわらず調製されたサンプルの微小粘度と流動性に関して観察された物理化学的差異（表3）はそれらの放出能力に影響を与えません（図4）。分子は主にヘッドグループ領域に影響を与えます。これらのデータは、中性および高pHで、pHLIPが1-パルミトイル-2-オレオイル- sn によって作製されたリポソームの表面に結合することを示す以前に報告された結果と一致しています。 -グリセロ-3-ホスホコリン（POPC）であり、融合や膜漏出を誘発しません。

結論

この研究は、pHLIPで装飾された小胞を調製する可能性を確認しています。サンプルは、4°Cの温度で少なくとも3か月間、血清の存在下で保存すると安定します。さらに、提案されたナノベクターは、親水性プローブを捕捉し、その放出を調節することができます。

pHLIPベシクルは、ナノキャリアの特徴に関する基本的な理解を得て、酸性度に敏感なナノベクターの合理的な設計を容易にするために完全に特徴付けられました。

The pHLIP association is driven by the hydrophobic interaction of the conjugated DSPE C18-chains inserting in the hydrophobic region of the nanovector. The pHLIP peptide is anchored and lies in the external headgroup region, prone to interact with target membranes at acidic pH and/or to release the nanovector content after bilayer rearrangement in low pH environment.

According to these findings, proposed pHLIP decorated vesicles could be useful to obtain a prolonged (modified) release of biological active substances for targeting tumors and other acidic diseased tissues.

略語

Chol:

Cholesterol

Cryo-TEM:

Cryo-transmission electron microscopy

DLS：

動的光散乱

DMPC:

1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine

DPH:

Diphenylhexatriene

pHLIP:

pH (low) insertion peptide

SAXS:

Small angle X-ray scattering

Span20:

Sorbitan monolaurate

Tween20:

Polyoxyethylenesorbitan monolaurate