溶解性を高めるためのオタマジャクシおよび球形のヘミンナノ粒子の調製と特性評価

はじめに

鉄は、電子伝達、貯蔵、酸素輸送などの体の代謝プロセスに不可欠な要素です[1]。鉄欠乏症は最も一般的な栄養欠乏症の1つであり、世界の人口の約20％に影響を及ぼしています[2]。鉄欠乏の最も否定的な結果は、シデロペニア性貧血です。多くの場合、需要が高い場合、それは主に鉄の不十分な食事摂取によって引き起こされます。人間の場合、食事中の鉄は主に2つの形態で体内に入ることができます。1つは主に野菜や植物性食品から放出される無機鉄（非ヘム鉄）で、もう1つはヘモグロビンまたはミオグロビンの分解から得られるヘム鉄です。動物。ヘミンは血液や肉製品に含まれており、多くのヘムタンパク質（ミオグロビン、ヘモグロビン、シトクロムbおよびcを含む）の成分であり、非ヘム鉄よりも2〜3倍吸収されやすい（50〜87％）[3]。 。最近、研究者はヘミンの生理学的役割の理解における大きな進歩を目撃しました。残念ながら、ヘミンは大きなテトラピロール大環状化合物が存在するため疎水性です[4]。中性水溶液へのヘミンの高い疎水性と溶解度の低さのために、さまざまな分野でのその適用は制限されてきました。したがって、ヘミンの溶解度を上げることが急務です。

この課題に対処するために、ヘミンの溶解度を改善するために多くの努力が注がれてきました。 Berner [5]は、部分酵素溶液タンパク質（大豆分離物、大豆粉、または大豆濃縮物）がヘム鉄と結合して鉄の吸収を高め、鉄のバイオアベイラビリティを改善できることを発見しました。王ら。 [6]は、結晶性ヘミンとL-アルギネートが水溶性ヘミン-アルギネートコアセルベーションを調製できることを示しました。これは、食品添加物、機能性食品、および医薬品の新しいヘム鉄サプリメントとして使用できます。張ら。 [7]は、ヘミンが7つのα結合グルコース単位の環状オリゴ糖によってβ-シクロデキストリンと結合し[1、4]、ヘミンの溶解度を大幅に改善できることを報告しました。ヘム鉄の溶解度の向上はある程度進んだものの、製造工程が複雑なため工業化は容易ではありませんでした。したがって、ヘミンの溶解度を改善するための簡単な方法を開発することは、依然として大きな課題です。

ナノサイエンスとナノテクノロジーは、機能性物質の開発、特に消費者の知覚に影響を与えず、特定の成分の取り込みを改善することなく生物活性化合物を含めることで、新しいソリューションを提供する可能性があります[8]。ナノ粒子には、疎水性物質の溶解性を促進するなど、いくつかの利点があります[9]。デュエム他[11]は、ナノテクノロジーを通じて新しいビタミンEベースのナノメディシンを開発しました。これは、生体適合性、薬物溶解性の改善、抗癌活性など、薬物送達において複数の利点を提供します。 Chang etal。 [12]は、無水コハク酸で修飾された短いグルカン鎖によって調製されたナノ粒子が疎水性ルテインをロードできることを報告しました。これにより、ルテインの水溶性が向上する可能性があります。ナノ粒子の大きな可能性にもかかわらず、ナノスケールのヘミンはまだ報告されていません。ヘミンナノ粒子の溶解度は、貴重な用途を持つ可能性のある遊離ヘミンと比較して増加する可能性があると仮定しました。

本研究の主な目的は、容易な透析技術を使用して異なる形状のヘミンナノ粒子を開発し、それらの溶解性を高めることです。初期ヘミン濃度および透析条件の調製パラメーターを評価した。さらに、形成されたヘミンナノ粒子のpH、熱処理、および塩に対する溶解性と安定性を評価しました。全体として、ヘミンの溶解度の改善には、さまざまな潜在的な応用分野があります。

材料と方法

資料

分子量カットオフが8〜12 kDaのヘミンおよび透析膜は、Beijing Solarbio Science＆Technology Co.、Ltd。（北京、中国）から購入しました。アセトン（CH ₃ COCH ₃ 、≥99.5％）は、Kant Chemical Co.、Ltd。（中国、莱陽）から調達しました。使用した他のすべての試薬は分析グレードのものでした。

ヘミンナノ粒子の調製

ヘミンナノ粒子は、透析法を使用して調製しました。0.1mlの濃塩酸で酸性化したアセトンに溶解した0.1 mg / mL（または0.5 mg / mL）のヘミン。ヘミン溶液を異なる日に透析し、水を毎日交換し、凍結乾燥してヘミンナノ粒子を得た。ヘミンナノ粒子の調製に対する可変パラメーターの影響を確認するために、ヘミン/水の体積比を1：3、1：5、1：10、および1:50に設定しました。栽培温度は4℃と25℃に設定しました。潜伏期間は1、3、5日に設定されました。

透過型電子顕微鏡（TEM）

ナノ粒子のTEM画像は、加速電圧80 kVの7700透過型電子顕微鏡（日立、東京、日本）で撮影されました。小さなサンプルドロップがカーボンコーティングされた銅グリッド上に堆積され、観察のために凍結乾燥されました。

平均サイズとゼータ電位の測定値

粒子の平均サイズ、ゼータ電位（ζ電位）、および多分散度指数（PDI）は、Malvern Zetasizer Nano（Malvern Instruments Ltd.、UK）を使用して、動的光散乱（DLS）を介して測定されました。サンプルをMilliQ水で希釈し、25°Cで分析しました。希釈サンプルの濃度は0.05％でした。

UV-Vis Absorption Spectrum

酸性化アセトン水溶液に溶解した遊離ヘミンおよびヘミンナノ粒子のUV-Vis分光測定は、UV-Vis分光光度計（TU-1810、北京、中国）で実施しました。分子吸収を1nm間隔で200〜800 nmの波長でスキャンして、スペクトルを取得しました。

溶解度アッセイ

純粋なヘミンとナノ粒子の定量的な水溶性は、Gidwaniらによって報告された方法に従って調査されました。 [13]。簡単に説明すると、純粋なヘミンとナノ粒子の過飽和溶液を、それぞれ試験管内の5mlの脱イオン水に別々に添加しました。試験管は、さまざまな温度（25、37、60、および80°C）で30分間絶えず（500 rpm）攪拌されました。次に、溶液を3500 g で遠心分離しました。 上澄みを酸性化アセトン水溶液で適切に希釈した。サンプルの濃度は、UV-Vis分光光度計によって640nmで測定されました。各測定について、基準としてブランクの酸性化アセトン水溶液を使用してベースラインを確立しました。

pH、温度、および塩の安定性

ナノ粒子のサイズ、ゼータ電位、PDI、および濁度（0.5 mg / mL）を測定し、初期値と比較して、ナノ粒子の安定性を評価しました。粒子懸濁液を10のグループに分けました。6つのグループを目的のpH値に調整し[2、3、5、7、9、11]、塩酸（0.1 M）または水酸化ナトリウム溶液（0.1 M）を使用しました。 3つのグループを25、60、および80°Cに加熱してから、室温に冷却しました。もう1つは、異なる濃度の塩化ナトリウム（NaCl、0、10、50、100、250、および500 mM）を使用してそれぞれ実施されました。混合溶液は25°Cで一晩放置しました。

フーリエ変換赤外（FTIR）分光法

ヘミンナノ粒子の化学構造は、FTIRスペクトル（Tensor 27、Jasco Inc.、米国メリーランド州イーストン）を使用して確認されました。 4 cm ^{− 1} の解像度で合計32回のスキャン OMNIC 8.0のラピッドスキャンソフトウェアを使用して蓄積し、単一のスペクトルを取得しました。スペクトル範囲は400–4000 cm ^{− 1} でした 。

蛍光分光法

遊離ヘミンおよびナノ粒子の蛍光測定は、蛍光分光光度計（F-7000、日立、日本）を使用して実行されました。サンプルの蛍光スペクトルは、波長300〜600 nmで、402nmで励起して得られました。

X線回折図（XRD）

遊離ヘミンとナノ粒子のXRDは、X線回折計（AXS D8 ADVANCE; Bruker、Karlsruhe、Germany）を使用して取得し、サンプルを2 θで調査しました。 4〜40°の範囲。遊離ヘミンとナノ粒子の相対的な結晶化度は、回折図にピークのベースラインをプロットし、Jivan etal。によって報告された方法に基づいてソフトウェアスペクトルビューアを使用して面積を計算することによって決定されました。 [14]。曲線の上と下の領域は、それぞれ結晶ドメインとアモルファス領域に対応していました。総面積に対する上部面積の比率を相対結晶化度として採用しました：

相対結晶化度（％）=ピーク下の面積/総曲線面積×100。

統計分析

すべての定量結果の3つのサンプルが得られました。結果は、平均値と標準偏差として報告されました。統計分析は、SPSS V.17統計ソフトウェアパッケージ（SPSS Inc.、米国イリノイ州シカゴ）を使用したダンカンの複数範囲検定によって実行されました。

結果と考察

ヘミンナノ粒子の形成と特性評価

透析法を使用して製造されたヘミンナノ粒子の形態とサイズをTEMで調べた。ヘミン濃度が0.5mg / mLの場合、さまざまなサイズのヘミンナノ構造が、さまざまなヘミン/水量比で、さまざまな透析日数で形成されました（図1、追加ファイル1：図S1〜S3）。ナノ粒子は明確に定義された球形であり、3日間の透析後のヘミン/水の体積比が1:10の場合、直径は50〜100nmでした。ヘミン/水の体積比が増加すると（1:50）、ナノ粒子は棒状の粒子に集められました（図1）。特に、透析時間が1日から3日に増加すると、ヘミンナノ粒子が均一に分散することがわかりました（追加ファイル1：図S1-S3）。透析の温度（4および25°C）は、粒子サイズとヘミンナノ粒子の分散にほとんど影響しませんでした（追加ファイル1：図S4）。

1：3（ a ）を含むさまざまなヘミン/水の体積比で3日間透析することによって調製されたヘミンナノ粒子のTEM画像 ）、1：5（ b ）、1：10（ c ）、および1:50（ d ）25°Cで。ヘミンの濃度は0.5mg / mL

図2は、ヘミン濃度が0.1 mg / mLのさまざまな透析日に調製されたヘミンナノ粒子の典型的なTEM画像を示しています。製品は主に明確に定義され、単一に分散し、構造的に異常で、オタマジャクシの形をしたナノ粒子でした。オタマジャクシのようなナノ粒子は、3日間の透析で分配されることが好ましい。オタマジャクシは、頭の最大幅（200 nm）から尾（100 nm）までのサイズに大きな違いが見られました。私たちの結果は、球形とおたまじゃくし形の両方のナノ粒子について、ヘミン/水体積比1:10で、25°Cで3日間透析した後、均一に分散したナノ粒子を形成できることを示しました。したがって、以下の研究では、これら2種類のヘミンナノ粒子を選択しました。

1日を含むさまざまな透析日で1:10のヘミン/水体積比で調製されたヘミンナノ粒子のTEM画像（ a ）、3日（ b ）、および5日（ c ）25°Cで。ヘミンの濃度は0.1mg / mL

ヘミンナノ粒子のサイズをさらに調べるために、DLS測定を使用してナノ構造の形成を確認しました。球形とオタマジャクシ形のナノ粒子の直径は、それぞれ約218.2±6.2と299.8±7.6 nmでした（図3a）。 DLSで測定されたナノ粒子のサイズは、TEMで測定された結果よりもいくらか大きかった。この違いは、水溶液中でナノ粒子が膨潤したことに起因していました。 DLS測定は、溶液中のナノ粒子の流体力学的直径を示すことが知られていました[15]。球形のナノ粒子のゼータ電位（-21.4 mV）は、オタマジャクシ形のナノ粒子のζ電位（-10.8 mV）の約2倍でした（図3b）。ヘミンナノ粒子のPDIも、粒子サイズ分布を分析するために決定されました。結果は、球形とオタマジャクシ形のナノ粒子のPDIがそれぞれ0.348と0.402であることを示しました（図3c）。この発見は、得られたヘミンナノ粒子が良好な多分散性を持っていることを示しました。

平均サイズ（ a ）、ζ電位（ b ）、PDIおよび濁度（ c ）、およびチンダル効果（ d ）異なる形状のヘミンナノ粒子の

光ビームがコロイド分散液を通過すると、光の一部が溶液中に存在するコロイド粒子によって散乱され、光ビームの発散につながります。この振る舞いはファラデー-チンダル効果と呼ばれます[16]。この場合、遊離ヘミン溶液はチンダル効果を示しませんでした（追加ファイル1：図S5）。それにもかかわらず、球形とオタマジャクシの両方の形状のナノ粒子の懸濁液でチンダル効果が観察され（図3d）、微細な懸濁液でのコロイドまたはナノ粒子の形成が確認されました。透析法によるヘミンナノ粒子の形成メカニズムは、外側の水相と内側の有機溶媒相との間の界面を介した溶媒の拡散に起因する可能性があり、その結果、ヘミンの溶解度が低下し、結晶核が形成された。その後、単結晶核の成長と自己組織化により、さまざまな形のヘミンナノ粒子が形成されました。

UV-Vis Absorption Analysis

上記の結果に基づいて、発色団の生成においてヘミンナノ粒子の2つの形状の間に違いがあるかどうかを調査しました。球形とオタマジャクシ形の両方のナノ粒子のUV-Visスペクトルは、265 nmで同じ吸収帯を示しました（図4a）。球形のナノ粒子は、667nmと775nmで狭い吸収帯を示しました。比較すると、オタマジャクシ型のナノ粒子溶液は、775nmのピークなしで658nmに広いピークを示しました。さらに、球形のナノ粒子の吸収強度は、オタマジャクシ形のナノ粒子の吸収強度よりも高かった。このような大きな違いは、オタマジャクシを球と先細の棒の合計と見なすことによっても、やや不完全な球の構成によっても説明できませんでした。長軸に沿ったプラズモン吸収に対応する電子振動は、遅延および/または反射経路上にあります。したがって、ヘミンナノ粒子の光学特性は、Huらによる報告と同様に形状に依存していました。 [17]、オ​​タマジャクシ型と球形の金ナノ粒子が異なる光学特性を持っていることを発見しました。

a UV-Visスペクトル、 b FTIRスペクトル、 c 蛍光発光スペクトル、および d 遊離ヘミン、球形ナノ粒子、およびオタマジャクシ形ナノ粒子のXRDパターン。ナノ粒子は脱イオン水に分散されました。 RC、相対結晶化度

遊離ヘミン溶液は344nmで最大吸収を示しました。これは、ポルフィリンに一般的に関連するソーレー帯に起因していました（追加ファイル1：図S5）。ヘミンナノ粒子の吸収帯は344から265nmにシフトしました。これは、ヘミンナノ粒子のπ-π共役効果が強化されたことを示唆しています。驚くべきことに、遊離ヘミンと比較して、両方の種類のナノ粒子は、高くて強い近赤外吸収を示しました。これは、光熱療法や光音響イメージングなどの吸収ベースのアプリケーションに非常に適しています[18]。マグノら。 [19]はまた、近赤外吸収を備えたポルフィリンナノ粒子が、磁気温熱療法やドラッグデリバリーシステム用の磁性ナノ粒子としても、光線療法や光診断への応用にかなりの関心を集めていることを報告しました。

溶解度

ヘミンの溶解度は重要な要素であり、体内の吸収効果に直接影響を与える可能性があります。さまざまな温度での純粋なヘミンとヘミンナノ粒子の定量的な水溶性をテストしました（表1）。温度が上昇すると、すべてのサンプルの水溶性が増加しました。たとえば、25、37、60、および80°Cでの遊離ヘミンの溶解度は、それぞれ0.009±0.000、0.060±0.002、0.144±0.004、および0.245±0.008 mg / mLでした（表1）。

25、37、60、80°Cで溶解した球形ナノ粒子の量はそれぞれ1.333±0.023、1.499±0.072、1.889±0.081、3.853±0.124 mg / mLであり、オタマジャクシ形ナノ粒子の量はそれぞれ0.997±0.045、1.231±0.035、1.521±0.058、1.795±0.050 mg / mL。ナノ粒子の水溶解度研究の結果は、純粋なヘミンと比較して有意な増加を示しました。球形のナノ粒子は、オタマジャクシ形のナノ粒子よりも25、37、60、および80°Cの温度で高い溶解度を示しました。この発見は、球形のナノ粒子の溶解度が、25℃での遊離ヘミンと比較して308.2倍高い可能性があることを示唆しています。この溶解度の増加は、主に独自のナノスケールの粒子サイズによるものでした。この結果は、GidwaniとVyasによって報告された他の研究と一致していました[13]。

FTIRスペクトル分析

FTIRスペクトルは、官能基の種類を識別するために使用できます。 3470 cm ^{− 1} のバンド これは主に、ヘミンからのN–Hおよびヒドロキシル基の伸縮振動に起因します（図4b）。 1460 cm ^{− 1} のバンド –CH ₃ の面外曲げ振動によるN–H面内振動によるものです。 ヘミンの芳香族ピロール環から。 1600 cm ^{− 1} のピーク は、ヘミンの表面結合カルボキシル基のC =Oの伸縮振動によるアミド結合の特徴的なピークであり、これは、二次アミド結合がヘミンに存在することを示しています。これらの結果は、Xiらの結果と一致しています。 [20]。ただし、3470 cm ^{− 1} のピーク ヘミンナノ粒子の量は遊離ヘミンのそれよりも広く、ナノ粒子間の水素結合相互作用の強化を明確に示しています。

蛍光スペクトル

遊離ヘミンおよびヘミンナノ粒子の蛍光特性も、蛍光分光法によってモニターされた。球形とオタマジャクシ形の両方のナノ粒子の蛍光シグナルは、遊離ヘミンと比較して、500 nmで最大の見かけの発光で増加しました（図4c）。これは、ナノ粒子の形成後のヘミンの溶解度の増加が原因である可能性があります[21]。

XRD分析

遊離ヘミンおよびヘミンナノ粒子の結晶性は、XRDによって確認されました。図4dに示すように、遊離ヘミンのXRDパターンは、2 θにいくつかの比較的強い反射ピークを示しました。 =6.8、9.6、11.5、16.2、21.5、および23.9°。球形のナノ粒子の特徴的なピークは遊離ヘミンのピークと同じであり、したがって、球形のナノ粒子の結晶構造がナノ粒子の配合において変化しなかったことを示している。ただし、オタマジャクシ型のナノ粒子の場合、ほとんどの特徴的なピークが消えました。さらに、球形およびオタマジャクシ形のナノ粒子の相対的な結晶化度は、遊離ヘミンの56.7％と比較して、それぞれ47.0％および35.7％に大幅に減少しました。これらの結果は、ナノ粒子製剤がヘミンの部分的な結晶領域を破壊する可能性があることを示しています。

安定性に対するpH、温度、塩濃度の影響

さまざまなpHレベル[2、3、4、5、6、7、8、9、10、11]でのインキュベーション後のヘミンナノ粒子のサイズ、PDI、ゼータ電位、および濁度の変化を測定しました（図5a 、b）。ヘミンナノ粒子のサイズはほとんど変化せず、酸性条件下での平均直径は約200 nmでした（図5a）。 2の低いpH値では、ヘミンナノ粒子のサイズは約122.4nmに減少しました。 pH 7で、ナノ粒子のサイズは293.6 nmに増加し、大幅に増加しました（ P <0.05）平均直径が400 nmを超えるアルカリ性条件下（pH 9および11.0）。ナノ粒子のPDIは酸性条件下で0.5未満であり、ナノ粒子の明らかな凝集がないことを示しています[22]。ナノ粒子のゼータ電位は、pH値の増加とともに減少しました（図5b）。ナノ粒子の濁度は、サイズにおいて同じ傾向を示しました。これらの結果は、ナノ粒子が酸性条件では安定しており、アルカリ性条件では不安定であることを示しています。

ヘミンナノ粒子の安定性。さまざまなpHレベルの影響（ a ）、温度（ c ）、および塩濃度（ e ）ナノ粒子の粒子サイズとPDIについて。さまざまなpHレベルの影響（ b ）、温度（ d ）、および塩濃度（ f ）ζ電位と濁度について

ヘミンナノ粒子のサイズ、PDI、ゼータ電位、および濁度に対する30分間の熱処理（25、60、および80°C）の影響を測定しました（図5c、d）。温度が上昇すると、ナノ粒子の粒子サイズ、PDI、ゼータ電位、および濁度がわずかに増加しました。結果は、ヘミンナノ粒子が優れた熱安定性を持っていたことを示唆している。同様に、イオン強度が増加すると、ナノ粒子のサイズ、ゼータ電位、および濁度も増加し、ナノ粒子の解離を引き起こしました（図5e、f）。

結論

この作業では、最初に、簡単な透析技術を使用してオタマジャクシ型および球形のヘミンナノ粒子を開発しました。これにより、25°Cで溶解度が308.2倍に大幅に向上する可能性があります。さらに、ヘミンナノ粒子は酸性条件下で安定しており、優れた熱安定性を示しました。さらに、両方のナノ粒子は強い近赤外線吸収を示しました。今後の作業は、有効成分をロードするための光熱応答ヘミンナノキャリアシステムの設計の詳細な研究に焦点を当てます。溶解性が向上したヘミンナノ粒子は、生物医学、食品、光線力学療法、光線力学-光線熱療法の分野で応用できる可能性があります。

略語

DLS：

動的光散乱

FTIR：

フーリエ変換赤外

TEM：

透過型電子顕微鏡

XRD：

X線回折図