緑茶抽出物を使用して合成された金ナノ粒子の形状依存性細胞毒性と細胞取り込み

はじめに

植物には、フラボノイド、サポニン、アルカロイド、ステロイド、クマリン、タンニン、フェノール、テルペノイド、炭水化物、タンパク質、アミノ酸などの天然の一次および二次代謝産物が含まれています。最近、植物抽出物がナノ材料、特に金、銀、酸化チタン、銅、パラジウム、酸化亜鉛、白金ナノ粒子などの金属ナノ粒子の合成に利用されています[1]。さまざまな植物化学物質が、還元剤として金属塩を金属ナノ粒子に変換することに積極的に関与しています。さらに、植物抽出物は、溶液中の金属ナノ粒子のコロイド安定性を維持するための安定剤としての役割を果たします。化学還元剤は一般的に有害であり、生物に対して毒性があります。対照的に、金属ナノ粒子の合成における植物抽出物の使用は、環境に優しく、環境に優しく、持続可能なものです。金属ナノ粒子の合成には、茎、果実、種子、葉、花などのさまざまな植物の部分が利用されます[1、2]。広範なレビューでは、還元剤として植物抽出物を使用した金ナノ粒子（AuNP）のグリーン合成が調査されています[2、3、4]。このグリーン戦略を使用して、合成ステップは1つのステップと1つのポットで実行されます。さらに、プロセスはシンプルで、簡単で、費用効果が高く、環境にやさしいです。 AuNPのサイズ、形状、およびトポグラフィーは、金の塩と抽出物の濃度、反応時間、反応温度、および溶液のpHに依存します。分光および顕微鏡技術は、UV-可視分光光度法、X線回折、フーリエ変換赤外分光法（FT-IR）、透過電子顕微鏡（TEM）、原子力顕微鏡（AFM）、走査型電子顕微鏡（ SEM）、および流体力学的サイズとゼータ電位の測定。これらの緑色のAuNPは、触媒、抗酸化剤、抗菌剤および抗癌剤として適用されます[5、6、7、8]。

著者の研究室では、植物抽出物（ Artemisia capillaris 、メハジキ 、イトヒメハギ 、 Caesalpinia sappan 、ミシマサイコ 、および Garcinia mangostana ）は、AuNPと銀ナノ粒子（AgNP）の両方をグリーン合成するための還元剤として使用されてきました[9、10、11、12、13、14、15、16、17、18]。 Aの空中部分。キャピラリス 抽出され、AgNPおよびAuNPの合成に使用されました[9、15、16]。調製したAgNPは、 Escherichia coli に対して優れた抗菌活性を発揮しました。 、エンテロバクタークロアカエ 、緑膿菌 、 Klebsiella aerogenes 、および Klebsiella oxytoca 抽出物のみの場合と比較して[15]。この結果は、AgNPと抽出物を組み合わせた相乗効果が抗菌活性の向上に貢献したことを示しています。興味深いことに、 Aを使用して合成されたAgNP。キャピラリス セチルトリメチルアンモニウムブロミドの存在下で、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌に対して抗菌活性を示しました。 [16]。さらに、 Aを使用して合成されたAuNP。キャピラリー 4-ニトロフェノール還元反応に対して触媒活性を示した[9]。 L。 japonicus 抽出物は、抗菌活性の顕著な増強を示すAgNPの合成に利用されました[10]。グラム陰性菌に対する抗菌活性は、グラム陽性菌に対する抗菌活性よりも大きいことが観察されました。 Pの根の抽出物。テヌイフォリア また、AuNPおよびAgNPの合成にも利用されました[11、17]。増強された抗凝固活性および抗菌活性は、 Pを使用して合成されたAuNPおよびAgNPでそれぞれ観察された。テヌイフォリア エキス。最も興味深いことに、 Cを使用して合成されたAgNP。 sappan 抽出物は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌に対して効果的な抗菌活性を示しました。アウレウス [18]。 Gの抽出物。マンゴスチン アポトーシス効果を持つ非対称ダンベル型AgNPを生成しました[14]。

以前の報告では、茶葉抽出物を使用したAuNPおよびAgNPのグリーン合成が検討されています[19、20、21、22、23]。 Kamalらは、25nm-AgNPの合成が成功したことを報告しました[19]。別の報告では、茶葉抽出物を使用して、20〜90nmの球状AgNPが合成されました[20]。合成されたAgNPは Eに対してわずかな抗菌活性を示した。コリ 。 3.42〜4.06 nmの球状AgNPも、Looとその同僚によって茶葉抽出物を使用して調製されました[21]。 Vaseeharanらは、茶葉抽出物を使用して抗菌性AgNPを合成しました[22]。合成されたAgNPは、病原性の Vibrio harveyi に対して有効でした。 感染。 Begumらは、紅茶の葉の抽出物を使用して、AuNPとAgNPの両方を合成しました[23]。現在まで、ほとんどの球状AgNPは茶葉抽出物を使用して合成されてきました。

本報告では、キトサンをAuNPのキャッピング剤として使用しました。キトサンは、その高い生体適合性、低いアレルギー誘発性、生分解性、および低い毒性のために、薬物/遺伝子送達媒体として研究されてきました[24、25、26]。キトサンは、カニ、アカザエビ、エビなどの昆虫や甲殻類の外骨格に豊富に含まれるキチンに由来します。キチンは N で構成される多糖類です -β（1-4）グリコシド結合によって結合されたアセチル-D-グルコサミン。キトサンは、異種の N によってキチンから得ることができます。 -脱アセチル化プロセス。キトサン自体は、抗菌、抗真菌、抗腫瘍、および抗酸化活性を持っています[25]。キャッピング剤として、キトサンは電気立体機構を介してAuNPに直接接触します[26]。キトサンナノ粒子は、細胞毒性を変更することなく、A549細胞による細胞取り込みのメカニズムに影響を与えます[24]。さらに、キトサンの脱アセチル化の程度は、分子量よりも細胞への取り込みと細胞毒性に影響を及ぼします[24]。

ほとんどの研究は、茶葉抽出物を使用した球状AgNPの合成に焦点を合わせています。ここでは、緑茶葉抽出物を利用して、金のナノスフェアとナノスターを合成しました。ナノスフェアは、シードを介したナノスターの合成のためのシードとして使用されました。比較のために、ナノロッドは一般的な従来の方法で合成されました[27]。 3つの異なる形状のAuNP（ナノスフェア、ナノスター、およびナノロッド）をキトサンでキャップして、生体適合性とコロイド安定性を高めました。これらのAuNPは、UV可視分光光度法、高分解能透過型電子顕微鏡（HR-TEM）、およびFT-IRによって特徴づけられました。動的光散乱（DLS）によって実行される流体力学的サイズ測定とゼータ電位測定は、キトサンでキャッピングする前後に実行されました。コロイド安定性は、塩溶液、緩衝液、および細胞培養培地で評価されました。細胞毒性を測定するために、3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）アッセイを4つの癌細胞に適用しました：AGS（ヒト胃腺癌細胞）、HeLa（ヒト上皮頸部腺癌）細胞）、HepG2（ヒト肝細胞癌細胞）、およびHT29（ヒト結腸直腸腺癌細胞）。 HepG2細胞におけるAuNPの細胞取り込みは、誘導結合プラズマ発光分析（ICP-OES）およびレーザーアブレーション誘導結合プラズマ質量分析（LA-ICP-MS）によって定量的に測定されました。

材料と方法

材料と計装

クロロ金酸三水和物（HAuCl ₄ ・3H ₂ O）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB）、キトサン（エビの殻から、75％以上脱アセチル化）、および3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミドはSigma-Aldrich（St 。ルイ、ミズーリ州、米国）。他のすべての試薬は分析グレードのものでした。 Shimadzu UV-1800またはUV-2600分光光度計を使用して、石英キュベット（Shimadzu Corporation、京都、日本）のUV-可視スペクトルを取得しました。 DLSによって実行される流体力学的サイズ測定およびゼータ電位測定は、NanoBrook 90Plus Zeta（Brookhaven Instruments Corporation、New York、USA）を使用して実行されました。 Varian 640 IRを使用してFT-IRスペクトルを取得しました（Agilent Technologies、米国カリフォルニア州サンタクララ）。測定されたサンプルは、KBrディスク法によって準備されました。 HR-TEM画像は、300 kVで動作するJEM-3010（JEOL、東京、日本）を使用してキャプチャされました。サンプルをカーボンコーティングされた銅グリッド（カーボンタイプB、300メッシュ、Ted Pella、米国カリフォルニア州レディング）にロードし、37°C​​で24時間オーブン乾燥させました。超音波処理には、モデルWUC-A22Hを使用しました（Daihan Scientific Co. LTD。、ソウル、韓国）。遠心分離と凍結乾燥には、それぞれ遠心分離機5424R（Eppendorf AG、ハンブルグ、ドイツ）とFD8518（IlshinBioBase Co. LTD。、京畿道、韓国）を使用しました。 AuNPの細胞取り込みには、Optima 8300 ICP-OES（PerkinElmer、マサチューセッツ州ウォルサム、米国）およびJ200タンデムLA-ICP-MS（Applied Spectra、カリフォルニア州フリーモント、米国）を使用しました。

緑茶抽出物の調製

河東緑茶研究所（大韓民国、慶尚南道河東）は、乾燥した緑茶の葉の贈り物を親切に提供してくれました。ブレンダーを使用して、乾燥した葉の粉末を調製した。抽出は、脱イオン水（2 L）と粉末の葉（200 g）を混合して行いました。抽出は、周囲温度で3回繰り返して超音波処理することにより、1時間進行させました。ワットマン濾紙を使用して水画分を濾過し、不溶性物質を除去しました。次に、濾液を遠心分離した（3,000 g 力、18°C、25分）、そして上澄みを集めた。採取した上澄み液をシリンジろ過し、ろ液を凍結乾燥した。凍結乾燥した材料を脱イオン水に溶解して、最終濃度が2％（ w / v ）のストック溶液を作成しました。 ）次のセクションで説明するグリーン合成の場合。

抽出物を使用した金ナノスフェアの合成

ナノスフェアの合成プロセスを図1aに示します。前のセクションで説明したストック溶液を合成に使用しました。ガラスバイアル内で、抽出物（最終濃度0.03％）とクロロ金酸三水和物（最終濃度0.5 mM）を混合し、水酸化ナトリウム（最終濃度1 mM）を添加しました。脱イオン水を加えて、最終容量を2mLにしました。オーブンのインキュベーションは、80°Cのドライオーブンで2時間行いました。ナノスフェアの表面プラズモン共鳴（SPR）は、300〜800nmの範囲でUV-可視スペクトルを取得することによって監視されました。ナノスフェアは、次のセクションで説明するナノスターの合成のシードとしても使用されました。

金ナノスフェアの合成。 a 合成プロセスと b の概略図 キトサンキャッピング前後のナノスフェアのUV-可視スペクトル。デジタル写真は、合成直後のナノスフェアを示しています

金ナノスターの合成

ナノスター合成プロセスを図2aに示します。前のセクションで説明したように合成されたナノスフェア（50μL）は、周囲温度でホットプレート上で磁気バーを使用して攪拌（750 rpm）されました。この溶液にクロロ金酸三水和物（0.25 mM、5 mL）を加えました。 15秒後、硝酸銀（1 mM、50μL）とアスコルビン酸（新たに調製した100 mM、25μL）の2つの溶液を同時に添加しました。次に、混合物を750rpmで5分間撹拌した。紫外可視スペクトルは、300〜1100nmの範囲で取得されました。

金ナノスターの合成。 a 合成プロセスと b の概略図 キトサンキャッピング前後のナノスターのUV-可視スペクトル。デジタル写真は、合成直後のナノスターを示しています

金ナノロッドの合成

ナノロッドの合成プロセスを図3aに示します。金ナノロッドの合成では、シードを介した合成が以前のレポートに従ってわずかな変更を加えて実行されました[27]。成長溶液は以下のように調製した。 20 mLのガラスバイアルに、クロロ金酸三水和物（10 mM、500μL）と臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB、100 mM、9.5 mL）を混合しました。溶液は黄褐色であった。次に、アスコルビン酸（新たに調製した100 mM、55μL）を加え、この溶液を黄褐色から無色になるまで撹拌した。硝酸銀（10 mM、100μL）を加え、10秒間振とうしました。この最終的な解決策は、成長解決策と名付けられました。シード溶液は以下のように合成した。 20 mLのガラスバイアルに、クロロ金酸三水和物（10 mM、250μL）とCTAB（100 mM、9.75 mL）を混合しました。次に、氷冷した新たに調製した水素化ホウ素ナトリウム（10 mM、600μL）を加え、2分間ボルテックスしました。溶液はシード溶液とラベル付けされた。シード溶液（12μL）を以前に合成した成長溶液と混合しました。紫外可視スペクトルは、400〜900nmの範囲で取得されました。

金ナノロッドの合成。 a 合成プロセスと b の概略図 キトサンキャッピング前後のナノロッドのUV-可視スペクトル。デジタル写真は、合成直後のナノロッドを示しています

ナノスフェア、ナノスター、およびナノロッドのキトサンキャッピング

キトサンキャッピングは、AuNPのコロイド安定性と生体適合性を高めるために採用されました。キトサンを1％酢酸に溶解し、最終濃度を0.01％に調整しました。次に、超音波処理を行ってキトサンを完全に溶解させました。この溶液は、次の手順でキトサンキャッピングのストック溶液として使用されました。以前に合成されたナノスフェアとナノスターの両方がキトサンストック溶液（0.01％）でキャップされました。キトサンストック溶液（30％、 v / v ）をAuNP溶液と混合しました（70％、 v / v ）。混合物を900rpmで2時間撹拌してキトサンキャッピングを完了した。ナノロッドについては、過剰なCTABを使用したため、遠心分離（14,000 rpm、15分、25°C）を行ってCTABを除去しました。ペレットからナノロッドを回収し、上記のようにキトサンキャッピングを行った。次に、UV-可視スペクトルを取得しました。

コロイドの安定性の評価

AuNPのコロイド安定性は、invitroおよびinvivoアプリケーションにとって重要です。キトサンキャッピングのある3種類のAuNPとキトサンキャッピングのないナノスフェアのコロイド安定性を、脱イオン水、5％ウシ血清アルブミン（BSA）、5％NaCl、PBS（pH 7.4）、ダルベッコ改変イーグル培地（ DMEM）、および完全培地。完全培地は、10％ウシ胎児血清（FBS）を含むDMEMでした。各タイプのAuNP溶液1ミリリットルを上記のように試験溶液と混合しました（0.5 mL）。混合物を25°Cで30分間インキュベートし、UV-可視スペクトルを取得しました。

細胞培養と細胞毒性

次の癌細胞株は韓国細胞株銀行（ソウル、韓国）から購入しました：AGS、HeLa、HepG2、およびHT29。 MTTアッセイは、AuNPのinvitro細胞毒性を評価するために実施されました。ピルビン酸ナトリウムを含むDMEMを利用した。細胞培養培地には、10％ウシ胎児血清、2 mM L-グルタミン、1％ペニシリン（100 units / mL）、およびストレプトマイシン（100 units / mL）が含まれていました。細胞を100mmの培養皿で培養し、約70％のコンフルエンスに維持しました。細胞培養の前に、3つの異なる形状のAuNPを真空蒸発させて、5mMの最終Au濃度を得ました。 96ウェルプレートに、細胞を5.0×10 ³ の密度で播種しました。 細胞/ウェル、およびインキュベーションは、CO ₂ の下で37℃のオーブンで24時間行った。 （5％）雰囲気。次に、5つの異なる濃度のAuNP（500μM、250μM、125μM、62.5μM、および31.25μM）を処理し、オーブン内でCO ₂ の下で37°Cでさらに24時間インキュベートしました。 （5％）雰囲気。次に、MTT試薬（5μL、脱イオン水中5％）を添加し、CO ₂ の下で37°Cのオーブンでインキュベートしました。 （5％）さらに3時間の雰囲気。蛍光マルチ検出リーダー（Synergy HT、Bio Tek Instruments、Winooski、VT、USA）を使用して、570nmで吸光度を測定しました。未処理の細胞をコントロールとして利用しました。

セルラー取り込み

各タイプのAuNPの細胞取り込みは、HepG2細胞を使用して定量的に測定されました。 24ウェルプレートに、細胞を5.0×10 ⁴ の密度で播種しました。 細胞/ウェル、およびインキュベーションは、CO ₂ の下で37℃のオーブンで24時間行った。 （5％）雰囲気。次に、5μM（最終濃度）の各タイプのAuNP溶液を処理し、オーブン内でCO ₂ の下で37°Cでさらに24時間インキュベートしました。 （5％）雰囲気。インキュベーション後、過剰なAuNPを含む溶液を除去し、細胞をトリプシンで処理しました。トリプシン処理されたセル内のAu濃度は、ICP-OESおよびLA-ICP-MSによって定量的に測定され、セル内のAu取り込み濃度が示されました。コントロールは、各タイプのAuNPの元のコロイド溶液の5μMでした。これは、Au濃度を取得するためにICP-OESおよびLA-ICP-MSによっても分析されました。

結果と考察

UV-可視スペクトル

通常、AuNPの合成を確認するためにUV-可視スペクトルが取得されます。 AuNPの特徴的なSPRは、可視近赤外の波長範囲で観察できます。さらに、AuNPのキャッピングは、一般に深色（または赤）または浅色（または青）シフトのいずれかを誘発します。さらに、浅色シフトは一般に赤と青のシフトと一緒に誘発されます。図1bに示すように、UV-可視スペクトルは300〜800nmの範囲で監視されました。ナノスフェアは、深みのあるバーガンディ色で532nmの特徴的なSPRを示しました。ナノスフェアのキトサンキャッピング後、最大SPRは浅色シフトとともに537 nmに赤方偏移しました（図1b）。ナノスターでは、濃い青色の溶液を含む広範囲のSPR波長（600〜800 nm）が観察されました（図2b）。ナノスターのキトサンキャッピングは浅色シフトを示し、キトサンキャッピングなしのAuNPよりも吸光度が低かった（図2b）。ナノロッドは、514nmと815nmの2つの異なるSPR波長を示し、淡いピンク色の溶液を形成しました（図3b）。ナノロッドのキトサンキャッピングは、浅色シフトとともに797 nmへの青方偏移を引き起こしました（図3b）。これらすべての結果を考慮すると、キトサンによるAuNPのキャッピングにより、SPR波長が変化し、シフトが誘発されました。 UV-可視スペクトルを注意深く調べると、3種類のAuNPがキトサンでうまくキャップされていることがわかりました。

流体力学的サイズとゼータ電位

次に、流体力学的サイズとゼータ電位を測定しました。結果を表1に示します。キトサンキャッピングを使用しない場合、ナノスフェアとナノスターの流体力学的サイズはそれぞれ28.4nmと97.8nmでした。流体力学的サイズがナノ粒子の球形にうまく調整されたため、ナノロッドの流体力学的サイズは測定されなかった。キトサンキャッピングにより、流体力学的サイズはナノスフェアでは190.7 nmに、ナノスターでは123.9nmに増加しました。キトサンのキャッピングは、流体力学的サイズの増加によって確認されました。ゼータ電位の変化は、AuNPの表面のキトサンキャッピングも反映しています。キトサンは正に帯電した多糖類です。したがって、キトサンキャッピングは、3つのタイプのAuNPすべてに対して正のゼータ電位をもたらしました。ナノスフェアの場合、ゼータ電位は-12.73から42.28mVに変更されました。ナノスターのゼータ電位は、-42.46から47.44nmに変更されました。ナノロッドの場合、CTAB（陽イオン界面活性剤）を合成に利用しました。したがって、元のゼータ電位はキャッピングなしで27.96mVでした。ナノロッドのキトサンキャッピングにより、ゼータ電位が33.23nmに増加しました。したがって、ナノスフェアとナノスターのゼータ電位の負の値から正の値への変化は、キトサンによるキャッピングの成功を明確に示しています。さらに、ナノロッドのゼータ電位が上昇し、表面がキトサンで覆われていることを示唆しています。

HR-TEM画像

顕微鏡はナノ粒子の研究に不可欠であり、ナノ粒子のサイズと形状に関する重要な情報を提供します。顕微鏡ツールは、分散状態、2次元および3次元の形態とトポグラフィー、材料の相対的な柔らかさ/硬さなど、さまざまな詳細情報を提供します。ナノスフェアは、HR-TEM画像でランダムに選択された75個の個別のナノ粒子の平均に基づいて、8.7±1.7 nmと測定されました（図4）。最も豊富なサイズは8〜9 nm（29.3％）で、次に9〜10 nm（12.0％）でした。キトサンキャッピングにより、ナノスフェアの形状は形状を変えることなく保存されました（図4c、d）。粒子の結晶性は、図4dに示す格子構造によって明確に示されました。隣接する格子間の距離は0.24nmと測定されました（図4d）。さらに、図4dの赤い矢印で示されているように、キトサン層も視覚化されました。図5に示すように、ナノスターはHR-TEMによって視覚化されました。ナノスターの測定値は99.0±47.0 nmで、19個の個別のナノ粒子の平均を表しています。格子構造は拡大画像で示されています（図5c）。示されているように、隣接する格子間の距離は0.24 nmと測定されました（図5c）。図5cの赤い矢印は、キトサン層を示しています。ナノロッドは図6に示すように視覚化されました。28個の粒子について行われた測定によると、平均粒子長と幅はそれぞれ60.4nmと16.4nmでした。粒子の長さを粒子の幅で割ったものとして定義されるアスペクト比は3.7でした。格子構造を図6cに示し、ナノロッドの結晶構造を確認します。隣接する格子間の距離は0.23nmと測定されました（図6c）。赤い矢印はキトサン層を示しています（図6c）。

金ナノスフェアのHR-TEM画像。スケールバーは a を表します 5 nm、 b 20 nm、 c 20 nm、および d 5nm。画像 a および b キトサンキャッピングなしで得られた、および c および d キトサンキャッピングで得られた。隣接する格子間の距離は0.24nmと測定されました。赤い矢印は、キャッピング後のキトサン層を示しています

金ナノスターのHR-TEM画像。スケールバーは a を表します 200 nm、 b 50 nm、および c 5nm。 d 平均サイズが99.0±47.0nmのナノスターの概略図。画像 a キトサンキャッピングなしで得られ、 b および c キトサンキャッピングで得られた。隣接する格子間の距離は0.24nmと測定されました。赤い矢印は、キャッピング後のキトサン層を示しています

金ナノロッドのHR-TEM画像。スケールバーは a を表します 100 nm、 b 200 nm、および c 5nm。 d 平均の長さと幅がそれぞれ60.4nmと16.4nmのナノロッドの概略図。画像 a キトサンキャッピングなしで得られ、 b および c キトサンキャッピングで得られた。隣接する格子間の距離は0.23nmと測定されました。赤い矢印は、キャッピング後のキトサン層を示しています

FT-IRスペクトル

緑茶には、多様な一次代謝産物と二次代謝産物が含まれています。具体的には、緑茶の主成分は、エピガロカテキン-3-ガレート、（-）-エピカテキン-3-ガレート、（-）-エピガロカテキン、（-）-エピカテキンなどのポリフェノールです[28]。 FT-IRスペクトルは、AuNPの合成に寄与する官能基に関する情報を取得するために取得されました。ナノスフェアのFT-IRスペクトルを抽出物のスペクトルと比較しました（図7）。 Au塩の還元反応に関与した可能性が最も高い主要な官能基は–OHでした。抽出物では、–OH官能基は3255 cm ^-1 に現れました （図7a）。合成すると、このピークは3300〜3341 cm ^-1 でより高い波数にシフトしました。 。この結果は、-OH官能基がC =Oに酸化されたポリフェノールに由来し、Au塩をAuNPに還元することを示しています。注目すべきことに、1716 cm ^-1 でのC =O官能基の出現 ナノスフェアでは、合成中の–OH官能基の酸化を明確にサポートしていました（図7b）。

a のFT-IRスペクトル 合成に使用される緑茶抽出物と b 金ナノスフェア

さまざまなソリューションでのコロイド安定性の評価

ナノ粒子のコロイド安定性は、診断および治療用途にとって重要な懸念事項です。コロイド安定性について、6つの異なる溶液をテストしました：（i）脱イオン水、（ii）NaCl（5％）、（iii）PBS（pH 7.4）、（iv）BSA（5％）、（v）DMEM、および（vi ）完全培地（10％FBSを含むDMEM）。各タイプのAuNPを試験溶液と混合した後、UV-可視スペクトルを取得しました。結果を表2と図8に示します。UV-可視スペクトルの3種類のAuNPのすべてで、わずかな赤または青のシフトを伴う浅色シフトが観察されました（図8a、c、およびe）。スペクトルの形状は保持され、コロイド溶液の凝集は観察されませんでした（図8b、d、およびf）。この結果は、コロイドの安定性が上記の試験溶液で非常によく保持されていることを示しています。

コロイド安定性の評価。 a および b キトサンキャッピングを備えたナノスフェア、 c および d キトサンキャッピングを備えたナノスター、 e および f キトサンキャッピング付きナノロッド、 g および h キトサンキャッピングのないナノスフェア。 DWは脱イオン水を表します

表2では、浅色シフトは、元の溶液の吸光度を100％に設定して、保持された吸光度のパーセンテージとして表されています。 3つすべてのAuNPで、コロイドの安定性は完全な培地で最もよく保持され、その後の細胞毒性実験に使用されました：ナノスフェア（65.3％）、ナノスター（93.4％）、およびナノロッド（80.2％）。タンパク質溶液であるBSA（5％）も、適度なコロイド安定性を提供しました：ナノスフェア（61.8％）、ナノスター（70.2％）、およびナノロッド（72.0％）。これらの結果は、ナノ粒子を覆うタンパク質が、キトサンキャッピングとともにAuNPのコロイド安定性にさらに有益な効果をもたらすことを示しています。キトサンキャッピングなしのナノスフェアのコロイド安定性も評価されました（図8g、h）。すべての溶液が浅色シフトを誘発した。テストされた溶液の中で、NaCl（5％）溶液のみが、浅色シフトとともに大きな赤方偏移を示しました。

細胞毒性

MTTアッセイを実施して、AGS、HeLa、HepG2、HT29の4種類のがん細胞に対する細胞毒性を測定しました（図9）。 3種類すべてのAuNPの細胞毒性は、Au濃度に依存していました。 4種類の細胞の中で、HepG2細胞で最も高い細胞毒性が観察されました。さらに、ナノロッドは4つの細胞型に対して最も高い毒性を示し、次にナノスター、最後にナノスフェアが続きました。具体的には、ナノロッドは非常に高い毒性を示しました。したがって、低範囲のAu濃度を含むナノロッドの細胞毒性も評価されました（図9e）。 8μMAuという低い濃度で、ナノロッドは濃度依存性の細胞毒性を示しました。 HepG2セルに対して、IC ₅₀ 値は、ナノスフェアの場合は127.1μMAu、ナノスターの場合は81.8μMAu、ナノロッドの場合は22.7μMAuでした。したがって、ナノロッドが最も細胞毒性が高く、次にナノスターが続き、ナノスフェアがHepG2細胞に対して最も細胞毒性が低かった。

MTTアッセイによって評価された細胞毒性（31.25〜500μMAu濃度）。 a AGS、 b HeLa、 c HepG2、および d HT29。 e 低Au濃度（8〜125μM）がHepG2セルで評価されました

AuNPの細胞毒性は、サイズ、形状、表面電荷の影響を受けることが報告されています[29、30]。 Faviらは、2種類の細胞（ヒト皮膚線維芽細胞とラット脂肪パッド内皮細胞）に対するAuナノスフェア（61 nm）とAuナノスター（34 nm）の細胞毒性を調査しました[31]。両方の細胞タイプで、致死濃度はナノスフェアでは40μg/ mL、ナノスターでは400μg/ mLで観察されました。彼らの結果は、ナノスフェアがナノスターよりも細胞毒性が高いことを示唆しており、サイズ、形状、および表面化学がAuNPの細胞毒性に影響を与える可能性が最も高いことを示唆しています。 Woźniakらは、HeLaとHEK293T（ヒト胎児腎臓細胞）の両方、すなわちナノスフェア（〜10 nm）、ナノフラワー（〜370 nm）、ナノロッド（〜41 nm）、ナノプリズム（〜41 nm）に対するさまざまな形状のAuNPの細胞毒性を報告しました。 〜160 nm）、およびナノスター（〜240 nm）[30]。興味深いことに、ナノスフェアとナノロッドは、ナノフラワー、ナノプリズム、ナノスターよりも細胞毒性が高かった。著者らは、ナノ粒子のサイズが小さいことと凝集プロセスが、彼らの研究におけるナノスフェアとナノロッドの細胞毒性の主な推進力であると説明しました。実際、多くの研究が細胞毒性に対するAuNPのサイズ効果に取り組んでいます[32、33]。 AuNPが小さくなると、細胞による取り込みが増加します。このより高い取り込みにより、細胞内のAuNPの濃度が高くなり、細胞に対する細胞毒性が高くなります。しかし、細胞内の低濃度のAuNPも高い細胞毒性を示します[34]。細胞内のAuNPの濃度は細胞毒性に影響します。ただし、AuNPの特性を考慮して理解することが重要です。 2つの異なる形状（ナノスフェア43 nm、ナノロッド38×17 nm）のAuNPの細胞毒性は、Tarantolaとその同僚によって上皮細胞で評価されました[35]。ナノスフェアは、ナノロッドよりも細胞毒性が高いと判断されました。さらに、ナノスフェアは上皮細胞膜の機能障害を誘発し、これは電気的細胞基質インピーダンスセンシングによって測定されました[35]。以前に議論されたように、多くの研究は現在、様々な細胞における異なる形状のAuNPの細胞毒性を調査しています。 AuNPの形状は同じままである可​​能性がありますが、多くの要因がAuNPの細胞毒性に影響を及ぼします。細胞毒性を評価するときは、サイズ、形状、物理化学的表面特性、濃度、曝露時間、細胞型などの要因も考慮する必要があります[34、36、37、38]。 AuNPの特性に加えて、細胞膜の破壊、酸化ストレス、細胞骨格の破壊、ミトコンドリア機能の喪失などの細胞毒性メカニズムも重要です[38、39]。現在、オートファジーとリソソーム機能障害がナノマテリアルの細胞毒性の説明として浮上している[40]。リソソームでは、ナノ材料は、リソソーム鉄を介した酸化ストレスと、ミトコンドリア機能障害および細胞死を引き起こすカテプシンおよび他の関連するリソソームヒドロラーゼの放出によって細胞毒性を誘発します。現在の報告では、ナノロッドは、テストされた4種類の癌細胞に対して最も細胞毒性がありました。したがって、私たちの将来の研究では、細胞毒性の詳細なメカニズムを調べます。

HepG2細胞への細胞の取り込み

HepG2細胞は、4種類の癌細胞の中で最も高い細胞毒性を示しました。したがって、細胞の取り込みを評価するためにこの細胞型を選択しました。 ICP-OESとLA-ICP-MSの2つの機器を使用して、細胞内のAu濃度を定量分析し、​​その結果を図10に示します。毒性がないため、細胞への取り込みを評価するために5μMのAu濃度を使用しました。 4種類のがん細胞の中でこの濃度で観察されました。取り込みはナノスフェア（58.0％）で最も高く、次にナノロッド（52.7％）とナノスター（41.5％）が続きました。前のセクションで示したように、細胞毒性は粒子の形状に依存していました（ナノロッド>ナノスター>ナノスフェア）。ただし、細胞への取り込みの順序（ナノスフェア>ナノロッド>ナノスター）は、細胞毒性の順序と一致しませんでした。ナノスフェアの細胞への取り込みが最も高かった。ただし、これらの粒子の細胞毒性は最低でした。これらの結果は、高い細胞取り込みが必ずしも高い細胞毒性を誘発するとは限らないことを示唆している。前述のように、細胞毒性に影響を与えるには、サイズ、形状、物理化学的表面特性、濃度、曝露時間、細胞型などのさまざまな要因が重要です。

HepG2細胞による細胞取り込み

3種類のAuNPの取り込みの程度の違い（41.5〜58.0％）は、熱力学的駆動力と受容体拡散速度論の下でのラッピング（つまり、膜がナノ粒子をどのように囲むか）間の競合に依存する可能性があります[41、42]。 ChithraniとChanは、HeLa細胞によるトランスフェリンコーティングされたAuナノスフェアとAuナノロッドの細胞取り込みを比較しました[42]。同じサイズ（つまり、ナノスフェアの直径とナノロッドの幅の値が同じ）では、ナノスフィアはナノロッドよりも高い取り込みを示しました。この結果は、ナノロッドと比較してナノスフェアの取り込みが多いという現在の報告での観察結果と一致しています。ナノロッドの取り込みでは、長さよりも幅の方が重要であり、アスペクト比を大きくすると取り込み速度が低下します[42]。ナノスターのサイズは99.0±47.0nmであり、3種類のAuNPの中で最大の粒子となっています。大きなナノ粒子（> 50 nm）の場合、受容体の拡散速度が遅いと、ラッピング時間が短くなります[42]。したがって、大きなナノ粒子、すなわち現在の報告ではナノスターの細胞への取り込みは低い。キトサンは、コロイドの安定性と生体適合性を高めるためにAuNPをキャップするために使用されました。キトサンキャッピングは、細胞表面の受容体と相互作用することにより、AuNPの細胞取り込みにおいても役割を果たすことができます。この問題を解明するには、詳細なメカニズムの研究が必要です。

結論

ナノテクノロジーの継続的な開発には、ドラッグデリバリーキャリアや抗がん剤などの生物学的に活性な化合物の媒体など、アプリケーションを成功させるためのナノ粒子の精巧な形状とサイズの設計が必要です。緑茶抽出物は、Auナノスフェアおよびナノスターの合成のためのグリーン還元剤として使用されました。興味深いことに、ナノロッドの細胞毒性はナノスフェアやナノスターの細胞毒性よりも高かったのに対し、ナノスフェアは4種類の癌細胞に対して最も低い細胞毒性を示しました。 HepG2細胞による細胞の取り込みは、おそらく形状とサイズに依存していました。ナノスフェアは細胞による最高の取り込みを示したが、ナノスターは最低の取り込みを示した。サイズと形状の最適化と表面修飾および機能化により、ナノ医療で将来使用するためのナノ粒子の開発につながります。

略語

AFM：

原子間力顕微鏡

AgNPs：

銀ナノ粒子

AGS：

ヒト胃腺癌細胞

AuNPs：

金ナノ粒子

CTAB：

セチルトリメチルアンモニウムブロミド

DLS：

動的光散乱

DMEM：

ダルベッコの改良イーグル培地

FBS：

ウシ胎児血清

FT-IR：

フーリエ変換赤外分光法

HeLa：

ヒト上皮子宮頸部腺癌細胞

HepG2：

ヒト肝細胞癌細胞

HR-TEM：

高分解能透過型電子顕微鏡

HT29：

ヒト結腸直腸腺癌細胞

ICP-OES：

誘導結合プラズマ発光分光法

LA-ICP-MS：

レーザーアブレーション誘導結合プラズマ質量分析

SEM：

走査型電子顕微鏡

SPR：

表面プラズモン共鳴