炎症誘発性癌イメージングのための効率的な造影剤としての環境適合性バイオコンジュゲート金ナノ粒子

要約

多くの癌では、早期発見が生存率を改善し、診断の遅れによる根治的切除に関連する罹患率を減らすための鍵となります。ここでは、結腸直腸癌および肝臓癌につながる可能性のあるラットの潰瘍性大腸炎（UC）および脂肪性肝炎の組織切片における慢性炎症過程、特にM2マクロファージを特異的に標的とする一次抗体結合金ナノ粒子（AuNP）の効率について説明します。それぞれ。この研究では、シンプルで安価な環境適合性のある方法で合成されたAuNPを、抗体抗COX-2、抗MIF、およびAlexaFluor®488（ALEXA）と簡単に結合させて、炎症を起こした蛍光抗体染色を実行できることを示します。組織。さらに、フローサイトメトリーによってM2マクロファージを標的とするために一次抗体結合金ナノ粒子（AuNPs）を使用できることを示しました。 30分間のAuNPによる組織切片の3つの免疫蛍光染色プロトコルと一晩のインキュベーション、および30分間のAuNPによるM2マクロファージ標識の1つのフローサイトメトリープロトコルを設計しました。免疫蛍光およびフローサイトメトリーの結果は、AuNP表面への抗体の直接吸着によって接合が達成されたことを示唆しています。蛍光抗体法（IF）およびフローサイトメトリー（FC）の標準ALEXAプロトコルと比較すると、ALEXAの代わりにAuNPを使用した30分のインキュベーションプロトコルは、IFでは約23時間から5時間に、FCでは4時間から1時間に減少しました。労力が少ないことが証明されているため、この方法は炎症誘発性の癌診断に適しています。

はじめに

医学および生物学の研究では、光学顕微鏡研究および診断手順、特に共焦点レーザー顕微鏡のための金ナノ粒子（AuNP）への関心が高まっています。抗体/ AuNPコンジュゲートを使用すると、単一粒子のレベルで生細胞（癌細胞など）への金の取り込みをリアルタイムで検出できるため、NPの細胞内量を推定できます[1,2,3]。

AuNPの物理化学的特性により、AuNPは、ゲノミクス、生体感受性、イムノアッセイ、臨床化学、検出、微生物や癌細胞の光熱分解など、多くの医学研究で使用できます[1]。 FaulkとTaylor [4]は、サルモネラ菌の表面抗原を直接電子顕微鏡で可視化するための、金コロイドとの抗体結合の最初の方法について説明しました。それ以来、抗体、レクチン、酵素などの生体高分子と結合したナノ粒子を、生化学、微生物学、免疫学、形態学などのさまざまな分野で応用することを目的とした多くの研究が開発されました[1,4]。癌研究では、AuNPは共役分子の蛍光強度を高めることができるため、X線と光学イメージングの両方のモダリティに非常に特異的で感度の高いAuNPベースの造影剤が使用されます[5、6]。

2014年に、AuNPが細胞培養の間接蛍光抗体法（IF）染色法に適用できることを実証しました[6]。本研究では、AuNPsを使用して免疫蛍光（IF）染色のための3つの新しい方法について説明します。ここでは、組織切片を使用し、これらの各方法の蛍光強度を、臨床応用のために蛍光技術を最適化することを目的として、AlexaFluor®488（ALEXA）抗体（A1）を使用した標準染色プロトコルと比較します[7,8,9 ]。

癌細胞ターゲティング用の蛍光イメージング（FI）は、癌に特異的な分子シグネチャーに基づく早期新生物の検出を改善するために、さまざまな光学イメージング技術を利用しています[10]。 2013年以降、FIを使用した臨床試験の数は急速に増加しています。スクリーニングは一般に、ライフスタイル要因、遺伝学、または病歴の組み合わせに基づく高リスク患者に対して考慮され、サーベイランスは、異形成/慢性炎症の診断を受けた患者または悪性腫瘍が疑われる患者に対して予約されています。 FIは、現在利用可能な技術と比較して改善された特異性と感度で悪性病変を特定するのに役立つ可能性があります。さらに、FIベースのスクリーニングは、癌性または前癌性病変を検出するための、より侵襲性が低く、より費用効果の高い方法を提供する可能性があります。具体的には、従来のスクリーニング方法よりも早く病変を検出するFIの能力は、治療結果の改善だけでなく、後の診断で診断される人に必要な集学的ケアの必要性を防ぐため、治療コストの削減にもつながります[11]。。この研究では、抗体/ AuNPsコンジュゲートが、蛍光顕微鏡による慢性炎症のイメージングにうまく適用できることを示しています。

メソッド/実験

調査の目的

この研究の目的は、金ナノ粒子の蛍光特性をIFおよびフローサイトメトリー技術でどのように使用できるかを実証することです。さらに、AuNPでテストしたプロトコルを、ALEXAを使用した標準プロトコルと比較し、標準プロトコルと同じくらい高速で信頼性の高いプロトコルでAuNPを使用できることを証明しました。

化学薬品および試薬

三塩化金（HCl中30 wt％）、ポリビニルピロリドン（PVP、MW =10.000）、水酸化ナトリウム、透析チューブセルロース膜、およびグリセロールは、Sigma-Aldrich Chemical Co（セントルイス、米国）の製品でした。硫酸と過酸化水素はVetec（リオデジャネイロ、ブラジル）から購入しました。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液とウシ血清アルブミン（BSA、5％）は、Life TechnologiesCorporation©（California、USA）から購入しました。抗COX-2（シクロオキシゲナーゼ-2 ）抗MIF（マクロファージ遊走阻止因子）一次抗体はSanta Cruz Biotechnology（サンパウロ、ブラジル）から購入し、Goat Anti-Rat IgG H＆LAlexaFluor®488二次抗体はABCAM®（ケンブリッジ、英国）から購入しました。 DNAの対比染色には、ABCAM®（ケンブリッジ、英国）のDAPI（20 ml）を含むフルオロシールド封入剤を使用しました。

AuNPの製造と特性評価および蛍光分光法

球状AuNP（7.1 nm）は、Gasparotto etal。による研究に従って製造および特性評価されました。 [12]。簡単に言うと、すべてのガラス器具はKMnO ₄に保管されていました。 + NaOH溶液を一晩、脱イオン水ですすぎ、H ₂に保持 O ₂ + H ₂ SO ₄ 解（1：1 v / v ）10分間、再度脱イオン水ですすぎ、使用前に乾燥させます。 PVP（0.20 g）と塩化金（6.80 mg）を10mlの水に溶解しました。別のビーカーで、グリセロール（0.18 g）とNaOH（0.080 g）を10mlの水に溶解しました。次に、グリセロール-NaOH溶液をAuCl ₃に加えました。 -次の最終濃度を生成するPVPソリューション：1.0 mmol / L ^-1 Au ³⁺ 、0.10 M NaOH、0.10 Mグリセロール、および10 g / L ^-1 PVP。最終的な混合物は、AuNPの形成のために深紅色を帯びていた。 AuNPのコロイド状紫外可視吸収スペクトルは、Evolution 60S UV-可視分光光度計（Thermo Scientific、MA、USA）を使用して取得しました。蛍光分光法は、RF-5301 PC分光蛍光光度計（島津製作所、京都、日本）を使用して実施しました。

実験計画

3つのプロトコルはすべて、ラットの2つの慢性炎症モデル、酢酸誘発性潰瘍性大腸炎（UC）[7]、およびアルコール誘発性脂肪性肝炎[8、9]の対照群でテストされました。

酢酸誘発性UCは、バイオテクノロジーセンター/パライバ連邦大学から入手した雌のウィスターラット（220±20 gのBW）で実施されました。動物は2つのグループに分けられました（ n =グループあたり5）：酢酸コントロールおよび非大腸炎ラット。動物を一晩絶食させ、ケタミン（70 mg / kg、10％）およびキシラジン（10 mg / kg、2％）で麻酔した。 UCは、MacPhersonとPfeiffer [13]によって最初に記述され、Millar etalによって修正された方法に従って誘導されました。 [14]。カテーテルを注意深く結腸に挿入した。次に、0.9％生理食塩水中の10％酢酸（0.5 ml）を結腸の内腔に注入しました。非大腸炎のグループは、結腸内に0.5 mlの0.9％生理食塩水を投与されました。結腸内注入の漏出を防ぐために、ラットを仰臥位のトレンデレンブルグ体位で30秒間維持した。

動物を一晩絶食させ、誘導の48時間後にチオペンタールの過剰摂取で安楽死させた。次に、結腸を無菌的に取り出し、PBSですすぎ、氷冷プレート上に置いた。結腸から脂肪と腸間膜を取り除きました。次に、各試験片の重量を測定し、一定の荷重（2 g）でその長さを測定しました。その後、結腸を縦方向に開き、Bell et al。によって記述された基準に従って、肉眼で見える損傷について0〜10のスケールでスコアを付けました。 [15]。

アルコール脂肪性肝炎は、リオグランデドノルテ連邦大学（UFRN）の生物物理薬理学部から入手したオスのウィスターラット（290±10 gのBW）で誘発されました。動物は2つのグループに分けられました（ n =グループあたり5）：アルコール性および非アルコール性ラット。エタノール溶液（7 g / kg体重30％ v / v ）アルコール依存症グループの慢性用量として使用されました。ノンアルコールグループの動物は、強制経口投与により等量の生理食塩水（0.9％NaCl）を経口投与されました。強制経口投与は、両方のグループで1日1回、28日間実施されました。

29日目に、7.5 ml / kgのケタミン（50 mg / ml）と2.5 ml / kgのキシラジン（20 mg / ml）の腹腔内注射によって安楽死を行いました。安楽死の前に、すべての動物群を12時間絶食させた。無意識になると、動物は心臓穿刺を受け、続いて肝臓が除去された。肝臓の断片を組織病理学的分析のために10％緩衝ホルムアルデヒドに浸しました。

酢酸誘発性UCおよびアルコール誘発性脂肪性肝炎の両方の動物を標準条件（12時間の明/暗サイクル、22±0.1°C、湿度50〜55％）で自由に飼育しました。食料と水へのアクセス。動物は、動物実験の倫理原則に従って扱われました。

組織学

各炎症モデルの陽性対照（酢酸対照およびアルコール対照）からの5つのパラフィンブロックを間接IF染色に使用しました。一次抗体抗COX-2および抗MIFは、異なるものを比較するために使用できる蛍光強度に関して信頼できる染色を提供することにより、それぞれ酢酸誘発性UCおよびアルコール誘発性脂肪性肝炎の優れた炎症マーカーであることがわかりました。プロトコル。

組織を10％緩衝ホルムアルデヒドで固定し、エチルアルコール（70％、80％、90％、95％、およびP.A.）で脱水し、キシレンで清澄化し、標準プロトコルに従ってパラフィンに含浸させました[8]。間接IF染色用の切片を準備する前に、スライドを60°Cのオーブンで24時間保持しました。

蛍光抗体法とプロトコルの設計

各動物の3つの組織切片（4μm）をキシレンで脱パラフィンし、99％エタノールから50％エタノールまでエタノールの濃度を下げながら一連の洗浄を行いました。最後に、組織切片をdH ₂で2回洗浄しました。 OとPBSで1回洗浄します。抗原の回収は、切片を0.05％Tween20を含む10mMクエン酸ナトリウムに95°Cで30分間、続いて室温（RT）で20分間置くことによって行いました。切片を70％アルコール中の0.1％スーダンブラックでRTで20分間インキュベートした後、0.02％PBS-Tween 20で3回洗浄することにより、バックグラウンドノイズ/シグナルを低減しました。サンプルを0.2％Triton-X-100で透過処理しました。 PBS（3回の洗浄、各5分）、PBSで洗浄した後、PBS、5％BSA、dH ₂でブロックしました。 O、およびTriton-X-100。スライドを湿度チャンバー内でブロック溶液とともに2時間インキュベートしました。表1と図1に示すように、抗COX-2および抗MIF一次抗体のインキュベーションは、3つの異なるプロトコル（NP1、NP2、およびNP3）に従って実行されました。これらのプロトコルは、一次抗体のインキュベーション時間が異なる2つのALEXAベースのプロトコルと比較されました。ほとんどの手順の標準プロトコルとして私たちの研究グループによって採用されたALEXA標準プロトコル（一晩のインキュベーション）（A1）とALEXA修正プロトコル（A2; 30分のインキュベーション）。 NP1は、ナノ粒子に依存する免疫蛍光染色法であり、一次インキュベーションに30分かかります。一次抗体を1％BSAで1：500（抗COX-2）と1：400（抗MIF）の比率で希釈し、各サンプルを湿度チャンバー内でRT（20°C）で30分間インキュベートしました。。次に、100〜150μlのAuNPをサンプルに添加し、RT（20°C）でさらに30分間インキュベートしました。 2番目のナノ粒子依存プロトコル（NP2）では、一次抗体を1％BSAで希釈し、スライドに直接適用し、冷蔵庫に一晩置いた。したがって、A2とNP1はどちらも30分のインキュベーションプロトコルですが、A2は二次蛍光抗体（ALEXA）を使用して実行されますが、NP1はフルオロフォアとしてAuNPを使用します。これは、一晩のインキュベーションプロトコルA1およびNP2にも当てはまります。それぞれのインキュベーション時間の後、各プロトコルのスライドをPBSで3回洗浄して、過剰な一次抗体を除去しました。次に、100〜150μlのナノ粒子をNP2の各スライドに追加し、ALEXA（1：400）をA1に追加しました。 AuNPs（NP2）およびALEXA（A1）との1時間のインキュベーション後、すべてのスライドをPBSで3回洗浄しました。

<図>

3番目のプロトコル（NP3）は、蛍光システムにおけるAuNPの増幅特性を調査するために設計されました。 NP3では、1％BSAでALEXAを希釈する際にAuNPを適用しました。各希釈液の蛍光強度をA1と比較するために、AuNPを使用したBSAでの2次抗体の3つの希釈液（1：200、1：400、および1：800）をテストしました。希釈液は、AuNPsの量がBSAの量に比例するように調製しました。たとえば、1：200希釈の場合、2μlのALEXAを199μlのAuNPs +199μlのBSAで希釈しました。 A1およびNP3の一次抗体のインキュベーション時間は約18時間（一晩）でしたが、ALEXA + AuNPs懸濁液のインキュベーション時間は1時間でした。

最後に、DAPIを含むFluoroshield MountingMediumを使用してサンプルをマウントしました。スライドは遮光ボックスに保管し、顕微鏡分析まで4℃で保存しました。蛍光画像は、AxioCam MRcを使用した蛍光および明視野イメージング（×20および×10対物レンズ、Carl Zeiss、イエナ、ドイツ）用のZeiss Observerz.1直立顕微鏡で取得しました。 Zeiss ZEN lite blueエディションソフトウェア（Carl Zeiss）の算術平均パラメーターを使用して、ALEXAチャネルの各画像の蛍光強度をピクセルごとに定量的に評価しました。各動物の少なくとも3つのサンプル（グループあたり5匹の動物）を分析し、×10の目的で各フラグメントから5枚の写真を撮影しました。

invitroでのM2分極TAMの誘導

M2マクロファージにおける一次抗体結合金ナノ粒子（AuNP）の評価には、RAW 264.7細胞（5×10 ⁵ 細胞/ウェル（12ウェルプレート）を、20 ng / mlのIL-4を添加した10％ウシ胎児血清を含む完全培地で24時間培養しました。 IL-4で処理した後、細胞を無血清DMEMで3回洗浄した後、同じ培地で48時間培養しました。 Telaval 31光学顕微鏡（ZEISS、オーバーコッヘン、ドイツ）を使用して細胞を分析しました。

フローサイトメトリー

IL-4と48時間インキュベートした後、RAW 264.7細胞とM2マクロファージ（1.5×10 ⁴ 細胞/ウェル（12ウェルプレート）をスクレーパーで収集し、100 ml PBS（PBA）中の0.5 gBSAで45分間ブロックした後、PerCP結合抗マウスCD163（1：1000）およびFITCとインキュベートしました。 -4°Cで60分間の結合抗マウスCD86（1：1000）。さらに、M2マクロファージはCOX-2およびMIF一次抗体で標識されているため、AuNPに結合しています。 M2分極TAMを収集し、PBS中の2％パラホルムアルデヒドで10分間固定した後、抗COX-2および抗MIF一次（1：100）と4°Cで60分間インキュベートしました。その後、Alexa標準プロトコル[16]に記載されているように、細胞をヤギ抗ウサギAlexa®Fluor488標識二次抗体（Thermo Fisher Scientific）で、室温で60分間のインキュベーション溶液（1：100）で標識しました。 AuNPがヤギ抗ウサギAlexa®Fluor488標識二次抗体に置き換わるプロトコル（N1）に従って、M2マクロファージを回収し、PBSで洗浄し、抗COX-2および抗MIF一次抗体（1：100）とインキュベートしました。）室温で30分間のインキュベーション溶液中。次に、細胞をAuNPs（1：5）とともに4°Cで30分間インキュベートしました（AuNPsは520 nmで励起）。最後の洗浄ステップに続いて、標識細胞をBD FACSCanto II（BD Biosciences、オランダ）およびFlowJoソフトウェア（バージョン10.1; Tree Star Inc.、英国）で分析しました。すべてのフローサイトメトリー分析は、サンプルを3回繰り返して、3回実行しました。標準のALEXAプロトコルとAuNPsプロトコルの比較を表2に示します。

<図>

統計分析

分散分析（ANOVA）とボンフェローニの事後免疫蛍光分析のために試験を行った。フローサイトメトリー分析では、示されているように、グループ間の有意差はANOVAとDunnのテストを使用して計算されました。 p <0.05は、実行されたすべての分析で統計的に有意であると見なされました。

結果

顕微鏡分析

図1aのセクションは、ヘマトキシリンとエオシンで染色された組織セクションを示しています（ネガティブコントロール）。酢酸によって誘発される慢性炎症プロセスを図1bに示します。これは、組織構造の喪失とその結果としての上皮の破壊、杯細胞の減少、損傷部位の近くの出血と白血球の存在を示しています。図では、脂肪滴の蓄積と炎症性浸潤（好中球とリンパ球）が、慢性的なアルコール曝露を受けたラットの肝臓で見られました。

蛍光強度の点では、AuNPはIF染色用の従来のフルオロフォアであるALEXAに似ていました。肝臓と結腸の両方のサンプルで、A1と比較した場合、NP1とNP2の蛍光強度の違いは最小限であるか存在しませんでした。図2には、抗COX-2および抗MIF一次抗体を使用してテストされたIFプロトコル間の多重比較が示されています。図2aおよびdは、A2、NP1、およびNP2の蛍光強度がA1プロトコルと比較して有意に異ならないことを示しています（^＃ p > 0.05）、30分のインキュベーションプロトコル（ALEXAまたはAuNPのいずれかを使用）が診断コンテキストに適用できる可能性があることを示唆しています。

さらに、NP3プロトコル（図2b、e）は、AuNPをALEXAに組み合わせて、検出された蛍光強度を増加させることができることを示しました（*** p <0.001）、A1で最初にテストされた1：400希釈と比較して、蛍光が減少することなく、ALEXAの希釈を2倍にすることができます（^＃ p > 0.05）。

最後に、病気のグループと健康なグループを比較して（図2f）、ALEXAまたはAuNPのいずれかでテストされたすべてのプロトコルが、抗原COX-2およびMIFによって特徴付けられる炎症プロセスの開始を検出するのに効果的であることを示しました。図3と4は、図2にグラフで示されているデータをサポートしています。ALEXAとAuNPはどちらも緑色の染色で表され、その分布は白血球浸潤と組織損傷の増加部位に対応しています。

臨床応用に関しては、NP1プロトコルが最も有望であることが証明されました。これは、標準のA1プロトコルと比較した場合、18時間の節約が可能になるためです。

フローサイトメトリー：一次抗体結合金ナノ粒子（AuNP）-標識M2マクロファージ

M2マクロファージをさらに特徴づけるために、IL-4で刺激されたRAW 264.7細胞におけるM1（CD86）およびM2（CD163）関連メーカーの発現をフローサイトメトリーで分析しました。フローサイトメトリーの結果は、CD163受容体などのM2関連マーカーがネイティブ細胞よりも有意に高いことを示しました（図5a、c、 p <0.001）CD86受容体の発現は、M2マクロファージとナイーブ細胞の間に違いを示さなかった（図5b、c、 p > 0.05）。結果は、IL-4（20 ng / ml）が古典的マクロファージからM2マクロファージへの変化を首尾よく誘導したことを示唆しました。このステップの後、M2マクロファージをCOX-2およびMIF一次抗体とインキュベートし、AuNPで標識して、一次抗体結合金ナノ粒子（AuNP）の効率を標準プロトコル（ALEXA）と比較しました。結果は、COX-2およびMIF抗体結合金ナノ粒子のいずれかを示しました（図5d、f、 p <0.001）またはALEXA（図5e、f、 p <0.001）は、染色されていないサンプルと比較した場合、M2マクロファージでより高い蛍光強度を示しました。

蛍光分光法

抗COX-2（図6a）、抗MIF（図6b）、およびALEXA（図6c）の非存在下および存在下での精製AuNPの蛍光発光スペクトルを測定するために、励起波長を固定しました。 320 nmで、発光は650〜900nmの範囲で記録されました。励起波長の増加は粒子の発光範囲を変化させなかったので、散乱プロセスの可能性を排除しました。蛍光発光は、抗COX-2取り込み（最高抗体濃度で11.93吸光度単位（au）増加）、抗MIF（最高抗体濃度で12.15 au増加）、およびALEXA（最高抗体濃度で3.18 au増加）でわずかに増加しました。最高の抗体濃度）AuNPとの組み合わせ。

ディスカッション

AuNPは、その化学構造とサイズにより蛍光特性を持ち、蛍光シグナルの増幅分子として機能できることが示されています。より具体的には、AuNP蛍光自体は、金原子の表面での親油性相互作用に由来します[17、18]。図6のデータは、銀ナノ粒子に関する研究の結果と類似しています。これは、吸着剤種と溶液に溶解した分子状酸素との競合により、蛍光発光が増加したためです。したがって、金ナノ粒子の蛍光発光の増加は、BSAがそれらの表面に吸着されているという事実に起因する可能性があります[19]。

蛍光シグナルは、表面プラズモン共鳴現象（SPR）の関数です。したがって、SPRは自由電子の集合振動であるため、自由電子の量の増加は、より強いSPR信号につながります。吸着されたBSAは、表面の自由電子が酸素分子に結合するのを防ぎ、蛍光シグナルの増加につながります[20、21]。抗COX-2、抗MIF、およびALEXAがAuNPに吸着され、それによってO ₂が妨げられた可能性があります。ナノ粒子の表面に到達することから。これは、蛍光シグナルの増加がさまざまな抗体の非常に低い濃度で発生した図6によってサポートされています。ただし、ALEXAがO ₂を引き起こすには、より高い濃度が必要であることに注意してください。 AuNPs表面の分離。

慢性炎症プロセスは、それぞれのモデルの酢酸またはエタノールによって引き起こされる損傷部位での免疫細胞、主にマクロファージの浸潤によって特徴付けられます。炎症はまた、病原体またはストレスの多い状態に応答した、いくつかのサイトカインおよびメディエーターの白血球依存性放出によって特徴付けられる。これらのサイトカインの中で、COX-2とMIFは炎症誘発性サイトカインであるため、いくつかの炎症プロセスのマーカーであることが知られています。 The green staining observed in Fig. 3 and Fig. 4 is due to the release of COX-2 and MIF cytokines, respectively.

In chronic UC and liver steatohepatitis, macrophages are the main cells found which can be classified into two major types:M1 macrophages and M2 macrophages. The classically activated macrophages (M1 macrophages) are proinflammatory and play a pivotal role in host defense against infection which is associated with iNOS and IL-23 production and their cell surface-expressed CD86 or HLA-DR that attract killer cells like neutrophils and/or direct Th1 (cytotoxic) responses and stimulate further M1-type responses [22]. Meanwhile, the alternatively activated macrophages (M2 macrophages) are associated with the responses to anti-inflammatory reactions as well as tissue remodeling [23]. In the tumor context, it has been documented that M2-polarized macrophages promote pro-tumor functions by production of a large array of growth factors such as COX-2 and MIF for tumor cells, which are essential for tumor proliferation [24].

It is well established that UC is an important risk factor for colonic epithelial dysplasia and adenocarcinoma [25, 26]. According to Agoff et al. [25], increased malondialdehyde (MDA) levels and upregulation of Bcl-2 during UC are potential mechanisms to explain the relationship between COX-2 overexpression and neoplastic progression. In UC, the inflammation boosts COX-2 activity, leading to genetic damage through increased production of MDA. MDA is a by-product of COX-mediated prostaglandin synthesis and lipid peroxidation, and it is also constitutively produced by COX-1. Since COX-2 upregulates Bcl-2 expression, it leads to resistance to apoptosis in UC-associated neoplasia [27].

MIF is a multipotent cytokine in the innate immune responses that contributes to hepatic injury driven by alcohol-induced steatohepatitis [28]. When steatohepatitis has developed, the liver morphology rarely goes back to normal, even after cessation. In addition, there is a higher risk of the development of cirrhosis, which is the last stage of alcoholic liver disease (ALD) before hepatocellular carcinoma (HCC) [29].

Studies show MIF presence in the sera after hepatic resection or expression in the course of liver cancer progression [30]. MIF is involved in COX-2 and PGE2 upregulation and directly promotes tumorigenesis by inhibition of p53 accumulation, which is a classic tumor suppressor gene that can promote cell cycle arrest and apoptosis in response to DNA damage [31].

In a previous study [6], we have demonstrated that AuNPs can be easily conjugated with the antibodies anti-β-catenin and anti-E-cadherin to specifically target colorectal carcinoma cells, whose clinical value can be found in an early diagnosis of cancer through non-invasive methods in body fluids such as saliva and urine. In addition, we developed a new protocol to decrease the 27 h that are usually needed for the standard protocol to about 1 h needed for our improved protocol, which makes this method eligible for a clinical colorectal cancer diagnostic.

In this study, we took advantage of the properties of AuNPs conjugated with primary antibodies and applied them for the indirect IF staining method of tissue sections. At this point, we cannot affirm whether the interaction of the antibody with the nanoparticle is purely physical or if there is a chemical bond, since the amount of antibodies used in this method are far too small to produce discernible signals in Fourier-transform infrared spectroscopy. Thus, we rely only on fluorescence data that suggest that conjugation was achieved by direct adsorption of antibodies on the AuNPs surface. Such enhancement has been rationalized in terms of competition between adsorbing species and molecular oxygen dissolved in solution, as explained before by Lima et al. [6]。 We found that the replacement of ALEXA by the AuNPs in NP1 saves about 18 h (similar to A2), when compared to standard protocol and NP2 that require about 24 h, each, from the antigenic retrieval to the assembling of the slides for microscopic analysis (Fig. 7 and Table 1). The time for incubation with the primary antibody was 30 min for A2 and NP1, but overnight (18 h) for A1, NP2, and NP3 (Fig. 7a and Table 1).

Moreover, we demonstrated MIF and COX-2 primary antibody-conjugated gold nanoparticles can be arranged on the surface of M2 macrophage as a fast alternative to analyze the immune profile of inflammation-induced cancer tissues by flow cytometry. Although the standard protocol is laborious, the intensity of marking to both the primary antibodies was higher than primary antibody-conjugated gold nanoparticles. However, the primary antibody-conjugated gold nanoparticles needed less reagents and the time saving was higher as seen in the standard protocol (4 h) and in primary antibody-conjugated gold nanoparticles N1 protocol (1 h) (Fig. 7b). These results suggest that M2 macrophages can be targeted with primary antibody-conjugated gold nanoparticles either to diagnosis or therapy.

The time saving, the specificity, and the low cost provided by NP1 are especially important in cancer diagnosis, when fast and accurate results are highly required. It is important to highlight that, although the models adopted for this work were based on inflammation diseases, the inflammation markers used in this study are highly cancer-correlated and AuNPs provide multiple possibilities for application in clinical research and diagnosis.

結論

All nanoparticle protocols tested showed similar fluorescent intensities to those observed in standard IF, extending the application of AuNPs, not only in research, but also in clinical diagnostics. When diluted with ALEXA, AuNPs allow greater dilutions with acceptable fluorescence intensity. More importantly, AuNPs can be used in faster protocols (e.g., 30-min incubation protocols), completely substituting ALEXA and providing a way to develop further technologies that will improve cancer diagnose and other diseases. We believe that these findings will contribute to advance research and diagnostic procedures that utilize IF methods as well as widen the applications of AuNPs in biotechnology.