ヒトの血液凝固欠陥を効果的に検出するための金ナノ粒子機能化におけるELISAと交互嵌合電極表面の補完

はじめに

健康な人間の生活を維持し、寿命を延ばすためには、医学の最前線ですべての側面を改善することが必須です。病気の診断は、医療分野の主要な分野の1つであり、病気や治療法をより簡単に特定できるように、さらに改善する必要があります。一方、インフルエンザやデング熱などの流行病は、蔓延を防ぐために初期段階で検出する必要があります[1,2,3]。さまざまなバイオマーカーを介して本物の検出が可能であることが実証されているさまざまな診断法があります[4、5]。以前に生成された診断システムの中で、酵素免疫測定法（ELISA）は、主要なウイルス性および細菌性疾患と分子種を特定するための「ゴールドスタンダード」と広く見なされています[6、7]。 ELISAを使用して、使いやすさ、精度、検出下限などの魅力的な特性を備えたさまざまな戦略が開発されています。さらに、さまざまな病気の同時検出と主要な病気のスクリーニングへの使用が実際には一般的です[8、9、10]。 ELISAは、ポリスチレン（PS）96ウェルプレート上の適切な抗体を使用して目的のターゲットを検出するために使用されるイムノアッセイです。標的分子の感度と選択性は、標的と抗体の結合親和性、一次抗体と二次抗体の相互作用、ELISA表面での効率的な標的固定化など、ELISAのさまざまな要因に大きく依存します。特に、PSプレートへのターゲットの固定化は、検出を制限する上で重要な役割を果たします。抗体またはタンパク質は、疎水性基と抗体との相互作用によってPSの表面に物理的に吸着する可能性があります[11]。いくつかの可能性があります。たとえば、抗体（またはタンパク質）の弱い結合またはPSプレート上の抗体の不安定性、および検出の欠陥につながる抗体（またはタンパク質）の不均一な分布が含まれます。固定化されたプレート上で抗体を適切に配向させると、ランダムに固定化された分子と比較して、検出が64倍以上向上することが証明されています[12、13]。したがって、PSプレート上にタンパク質または抗体を均一に効率的に固定化するための適切な手順を見つけることが重要な必要性です。さまざまな研究者が、ポリビニルベンジルラクトノイルアミドによる光化学反応や界面活性剤の存在下でのタンパク質の固定化など、化学的または物理的プロセスによるPSELISAプレートへのタンパク質の固定化を利用しています[14、15、16]。 Dixit etal。 [8]は、検出限界を改善するためにアミン修飾PSプレートに抗体を固定化し、固定化ステップ前の（3-アミノプロピル）トリエトキシシラン（APTES）と抗体の予備混合により、感度が54倍向上することを示しました。従来のELISAであり、10 pMの検出限界に達しました[8、17]。

本研究では、金ナノ粒子（GNP）を利用したPSELISAプレートへのタンパク質固定化の新しい方法を紹介しました。 GNPは、センサー開発の分野で最も強力なツールの1つです。それらは、水への分散の容易さ、生物学的不活性、および表面機能化との良好な適合性などの肯定的な特性を提供し、均一なナノサイズに調整することができます[18、19、20、21、22、23]。 GNP標識抗体は、インフルエンザウイルスと導波路モードセンサーのFIXによる検出限界を改善することが証明されています[21、22、23]。 GNPは、導波路モードセンサー、表面プラズモン共鳴、高性能検出用のラマン分光法など、あらゆる種類のセンサーで使用されています。さらに、GNPは比色分析でも使用されており、GNP表面でのアプタマーまたは抗体の結合を追跡して、肉眼で分析物を検出しました。研究者はまた、検出を強化するためのELISA法におけるGNPの使用に焦点を合わせています[24]。以前は、GNP結合抗マウスIgG-HRPは、Pb（II）の検出を改善し、9 pg / mLの検出限界に達しました[25]。ラクシュミープリヤ他は、GNPに対する一次抗体と二次抗体の結合により、結核の原因となるESAT-6タンパク質の検出が改善されることを発見しました[9、26]。ここでは、GNPを使用して、APTESを利用した化学修飾によりPSELISA表面にタンパク質を固定化しました。このアプローチには2つのステップが含まれます。APTESを使用したアミン基によるPS表面の機能化と、それに続くアミン修飾PSプレートへのGNP結合タンパク質の固定化です。 APTESのアミン基は、PSELISA表面のCOOH基に結合できます。一方、陰イオン性クエン酸イオンで安定化されたGNP複合タンパク質は、静電相互作用によって陽イオン性APTESに結合できます[11、27、28]。 APTESのアミノ末端基は、GNPのクエン酸基を置換し、PSプレートに化学的に固定します[29]。 APTESの正に帯電したアミン基も、負に帯電したGNPを引き付けます。さらに、APTES処理により、PS基質がより疎水性になるように変化します[30]。

化学的に修飾されたELISAプレートとGNP結合を使用して、ヒトの血液凝固カスケードから第IX因子（FIX）を検出しました。 FIXは血液凝固系の重要なタンパク質であり、血流中のFIXの濃度が低いと、凝固不全につながります。 GNPを介したELISAプレートへのFIXの固定化の強化により、低レベルのFIXを検出するための潜在的な経路が可能になります。 GNP修正ELISAプレートはFIX検出の劇的な改善を示しました。さらに、ヒト血清中のFIXの検出も実証し、現在の戦略をELISAで使用して他のバイオマーカーを検出することができます。上記の研究をELISA基板で補完するために、電気化学誘電体センサーで広く使用されている別の交互嵌合電極表面（IDE）に上記の戦略を適用して、ヒト希釈血清サンプル中の純粋なFIXおよびFIXを検出しました（図1a、b）。 。

a GNP支援ELISAの概略図。 GNPはタンパク質と事前に混合され、APTES修飾ELISA表面に固定化されました。次に抗体を加えた。最後に、HRPの基質を使用してターゲットを検出しました。 b GNP支援IDEの概略図

材料と方法

試薬と生体分子

（3-アミノプロピル）トリエトキシシラン（APTES）とヒト血清は、Sigma-Aldrich（USA）から購入しました。 FIXタンパク質および抗FIX抗体はAbcam（マレーシア）から入手しました。抗マウスIgG結合西洋ワサビペルオキシダーゼ（抗マウス免疫グロブリンHRP）は、Thermo-Scientific（USA）から購入しました。 ELISAプレートはBectonDickinson（フランス）から調達した。 ELISA 5xコーティングバッファーはBioLegend（UK）から入手しました。ウシ血清アルブミン（BSA）およびHRP基質は、Promega（USA）から入手しました。金ナノ粒子（GNP）（10、15、および80 nm）はNanocs（USA）から入手しました。分析ELISAリーダーは、Fisher Scientific（マレーシア）から入手しました。

シラン試薬とGNPによる最適化

APTESとGNPの適切な濃度を最適化するために、ELISAプレート上でAPTESとGNPのさまざまな組み合わせを使用して固定化プロセスを実行しました。最初に、ELISAプレートを1％KOHで1時間ヒドロキシル化しました。次に、1.25、2.5、および5％APTESをELISAプレートの別々のウェルに室温（RT）で5時間結合させました。その後、25、50、および100％の濃度で希釈されたGNP（蒸留水中）をAPTES修飾表面に固定化しました。次に、200nMのFIXをGNP表面に結合させました。次に、残りの結合部位を2％BSAを使用してブロックし、次にFIX抗体の1：1000希釈を導入し、続いて抗マウス-IgG-HRPの1：1000希釈を添加しました。最後に、FIX相互作用を検出するために基板が追加されました。ウェルは、洗浄バッファー（0.05％Tween 20、pH 7.4を含むPBSバッファー）を使用して、各ステップの間に5回洗浄されました。最後に、光学密度（OD）をELISAリーダーで405nmで測定しました。この実験では、15nmサイズのGNPを使用しました。

GNPの必要なサイズの決定

最適な条件下でAPTESとGNP希釈の適切な濃度を決定した後、10、15、および80 nmのGNPをFIX固定化のために試し、最適なサイズを決定しました。上記と同じ実験条件を使用した。 FIX固定化には2.5％のAPTESと50％のGNP希釈液を使用しました。

FIXの特定の選択的検出

また、ELISAプレート上でタンパク質と抗体の特異的結合を確認しました。そのために、3種類の対照実験を利用しました。コントロールおよび特定の条件として機能するように、ELISAプレートに次の順序の生体分子を固定化しました。コントロール1（C1）、FIX-BSA-抗マウスIgG-基質。コントロール2（C2）、FIX-BSA-FIX抗体-基質;コントロール3（C3）、BSA-FIX抗体-抗マウスIgG-基質、特異的（S）、FIX-BSA-FIX抗体-抗マウスIgG-基質。

ELISAプレートと従来のELISAでのGNP結合FIXの検出

ＦＩＸは、ＡＰＴＥＳ－ＧＮＰ－ＦＩＸおよびＡＰＴＥＳ－ＧＮＰプレミックスＦＩＸなどの２つの異なる方法によってＧＮＰ修飾ＥＬＩＳＡプレートを使用して検出され、これらの方法は、従来のＥＬＩＳＡと比較された。次の手順で手順を構成します。従来のELISA：（i）FIXタンパク質を0〜200 nMの濃度で1×コーティングバッファーで希釈し、（ii）2％BSAでブロックし、（iii）FIX抗体の1：1000希釈を加えました。（iv）1：抗マウスIgG-HRPの1000希釈液を添加し、（v）HRPの基質を添加し、405nmで測定しました。

APTES-GNP-FIX（方法1）：（ i）PSプレートを1％KOHで活性化、（ii）2.5％APTESをRTで5時間ELISAプレートに添加、（iii）受け取った15 nmの25％ GNPを添加し、4°Cで一晩保持しました。（iv）0〜200 nMの濃度のFIXをGNP表面に独立して結合させ、（v）残りの表面を2％BSAでブロックしました。（vi）1： FIX抗体の1000希釈液を添加し、（vii）抗マウス-IgG-HRPの1：1000希釈液を添加し、（vii）HRPの基質を添加し、405nmで測定しました。

APTES-GNPプレミックスFIX（方法2）：（ i）PSプレートを1％KOHで活性化し、（ii）2.5％APTESをRTで5時間添加し、（iii）異なる濃度の25％15nmGNP溶液をプレミックスしました。 FIX（RTで30分間インキュベート; 0〜200 nM）をAPTES修飾表面に固定化し、（iv）残りの表面を2％BSAでブロックし、（v）FIX抗体の1：1000希釈液を添加しました。 （vi）抗マウスIgG-HRPの1：1000希釈液を添加し、（vii）HRPの基質を添加し、405nmで測定しました。

ヒト血清中およびスパイク後のFIXの検出

ヒト血清中のFIXを検出するために、ここではFIXの代わりに血清をGNPとプレミックスしました。 20から1280までの血清希釈液を滴定し、GNPと混合して、FIXの検出を評価しました。以前の実験と同様に、他の実験条件と濃度が使用されました。

スパイク実験は、さまざまな濃度のFIX（0〜8 nM）をヒト血清の最適化された希釈液にスパイクし、ELISAプレートに固定化する前にGNPと事前に混合することによって実施しました。他の実験条件と濃度は、以前の実験と同様に使用されました。

インターデジタル電極表面加工

インターデジタル電極（IDE）表面製造プロセスには、ウェーハ洗浄、酸化物層成長、ネガティブフォトレジストスピンコーティング、フォトレジストパターニング、アルミニウム金属蒸着、フォトレジスト除去、およびウェーハダイシングが含まれます。このプロセスは、緩衝酸化物エッチャントで洗浄されたウェーハで開始され、続いて高温（1000°C）でシリコンウェーハ（310 nm）で酸化され、次にアルミニウムを使用してエッチングプロセスが実行されました。ネガ型フォトレジストは、2000rpmの回転速度でスピンコーターによって堆積されました。レジストは、UV光（240秒）にさらされた後、RD–6によって現像されました。次に、240 nmのアルミニウムを熱蒸発器（Edwards Auto 306）によって3.0E-5Torrで堆積させました。固体IDEが現れるまでアセトンを使用してフォトレジストを剥がし、次にさいの目に切って単一のIDEを作成した。最後に、酸化亜鉛層を上に重ねて、究極の生体分子固定化を実現しました[31]。酸化亜鉛の付着を進める前に、最初に検出面を1 M水酸化カリウム（pH 9.0）で洗浄しました。

GNPで修正された表面でのFIXの検出

GNP修飾ELISA基質を用いたFIXの最適化と検出効率の確認後、上記の検出を補完するために、IDE表面で同じ表面修飾を実行しました。最初に、IDE酸化亜鉛表面は、エタノールで希釈した2.5％APTESをRTで3時間添加することにより、アミンで修飾されました。その後、表面をエタノールで5回洗浄し、GNP（25％）とFIXのプレミックスを加えました。次に、残りの表面をエタノールアミンでブロックし、次にFIX抗体を加えてFIXを検出しました。電流信号の付随する変化に気づきました。検出限界を確認するために、さまざまな濃度のFIXをGNPと個別に混合し、アミン修飾IDE表面に固定化してから、抗体で検出しました。検出限界は3σ計算により決定されました。 GNPと混合された希釈ヒト血清中の豊富なFIXは、アミン修飾IDE表面に固定化され、その抗体によって検出されました。上記の表面の製造は、前に述べたように続いた[31]。

結果と考察

PSELISA表面での前処理

ポリスチレン（PS）ELISA表面へのタンパク質または抗体の効果的な固定化は、ターゲットとプローブの相互作用の検出限界を明らかに改善します。 ELISAプレートへのタンパク質または抗体の付着には、さまざまな固定化方法が使用されています。この作業では、タンパク質または抗体を固定化するために、GNPを使用して化学的に修飾されたELISA表面を導入しました。重要であると広く報告されている第IX因子（FIX）などの重要な凝固因子の1つを使用したかった[32、33、34、35、36]。図1は、ポリスチレンELISA表面でのタンパク質固定化の概略図を示しています。まず、ELISA表面を1％KOHで活性化しました。 KOH前処理がない場合、PS表面に結合するAPTES分子の数は最小限に抑えられます。これは、ポリマーへのAPTESの初期吸着を促進する極性および水素結合受容基がないためです[11]。 KOH処理後、GNPを捕捉するために、適切な濃度のAPTESによって表面をアミンで修飾しました。

GNPの特性評価

先に進む前に、受け取ったままのGNP（15 nm）を、光学的、形態学的、およびサイズ分布の測定によって特性評価しました。図2aは、GNPのUV-Vis分光光度分析を示しています。これは、550nmで最大ピークを示しているようです。透過型電子顕微鏡観察では、GNPのサイズは〜15 nmであり、形状は良好であることが示されています（図2bおよび挿入図）。フーリエ変換赤外分光分析は、波数500から4000 cm ^-1 まで実行されました。 （図2c）。 1650 cm ^-1 に見られる単一のピーク 金は別のマイナーピークとともに注目されましたが、アミン基のピークの存在はAPTESの結合を表しています。さらなるサポートは、ボリューム分布とゼータ電位分析によって提供されました。この分析に基づいて、体積分布は、サイズ分布にわずかな変動があり（図2d）、ゼータ電位が-6.9であり、この研究で使用されたGNPの安定性を表していることを示しています（図2e）。

金ナノ粒子の特性評価。最適なサイズ15nmで実行。 a UV-Vis分光光度分析。 550nmに顕著な単一ピークが見つかりました。 b 透過型電子顕微鏡観察。図の挿入図は拡大画像を示しています。スケールバーが表示されます。 c フーリエ変換赤外分光分析。金とNH ₂ の見かけのピーク位置 が示されています。 d GNPの体積分布分析。得られた分布を示します。 e ゼータ電位分析。値は− 6.9

であることがわかりました

GNPをキャプチャするためのアミン表面の準備と最適化

APTESの量は、PS表面へのGNPまたは抗体の固定化に大きく影響します。一般に、非常に混雑しているAPTES分子は、偽陽性の結果を生み出す可能性があります。 APTESはいくつかのセンサー表面に抗体を固定化するために1〜2％使用されてきたため、ここでは、無水エタノールで調製した1.25〜5％のAPTESを滴定しました。次に、私たちの目的は、APTESで修飾された表面にGNPを固定化することでした。より多くのGNPが混雑効果をもたらす可能性があるため、適切な希釈を最適化するために、15 nmの25、50、または100％のGNPをAPTES修飾表面でテストしました。これらの修飾された表面では、250nMのFIXがFIX抗体で検出されました。図2aおよびbに示すように、1.25％APTESは、GNPのすべての希釈（25、50、および100％）でより低い吸光度（OD）を示しますが、2.5および5％APTESは、50および100％の両方でより高い吸光度を示しました。 GNP。同時に、信号対雑音比は、APTESおよびGNP濃度の増加とともに改善されました（図3a、b）。 50％および100％GNPを含む5％APTESは非特異的結合を示し、2.5％APTESを含む50および100％GNPは同様の吸光度を示しました。これらの得られた値に基づいて、さらなる実験のために2.5％APTESと25％GNPの希釈を選択しました。

APTESとGNPの量を決定します。 APTESの3つの異なる濃度（1.25、2.5、および5％）が、GNPの3つの希釈（25、50、および100％）とともに使用されました。 a 基板を追加した後のFIXの視覚的検出。 FIXのないコントロールレーンが含まれていました。 b 最適なAPTESレベルのグラフ表示。 2.5％のAPTESと25％のGNPが最適であることがわかりました

潜在的なGNPサイズの決定

APTESとGNP希釈の最適化の後、次にGNPの適切なサイズを評価しました。表面積はタンパク質の固定化に重要な役割を果たすため、ここでは、10、15、および80nmを含む3つの異なるサイズのGNPを固定化しようとしました。異なるサイズのGNPは、タンパク質を引き付けるための異なる表面積と異なる電荷を持ち、APTES修飾表面での結合能力も異なります。図4aに示すように、250 nM FIXは、10、15、および80nmのGNPで修飾されたELISA表面で検出されました。 15nmと80nmのGNPは、250nMのFIXの検出でほぼ同じ0.4（OD）の吸光度を示しますが、10nmサイズのGNPは0.34ODしか示しません。この実験から、15または80 nmのGNPがさらなる実験に適していることを確認し、15nmのGNPを継続しました。

a GNPの理想的なサイズを決定する。 10、15、および80 nmの間で、15および80nmが同様の結果を示しました。 FIXによる検出限界を決定するために15ナノメートルが使用されました。 b FIXの検出のための対照実験。 ３つの異なる対照実験（Ｃ１－ＦＩＸ抗体なし； Ｃ２－抗マウスＩｇＧなし； Ｃ３－ＦＩＸなし）が実施された。いずれの対照実験でも有意なシグナルは見られなかった。図の挿入図は視覚的な結果を示しています

非汚染性と高性能を確認するための実験的戦略

GNP修飾ELISA表面でFIXを検出する前に、「材料と方法」のセクションで説明したように、3種類の対照実験を行いました。図4bに示すように、コントロール実験1、2、および3（C1、C2、およびC3）のウェルでは有意な吸光度を観察できませんでした。特定の実験（S）では、吸光度のレベルが高いほど、見かけの色の変化と明らかに関連しています。 C1の場合、FIX抗体を追加しませんでした。これにより、FIX抗体がFIXと特異的に相互作用することが確認されます（S）。 C2に抗マウスIgGが存在しない場合、観察可能なシグナルは見つかりませんでした。これにより、FIXと抗体、続いて抗マウスIgGの適切な相互作用がさらに定着します。 C3では、FIXがない場合、有意な吸光度を測定できませんでした。これらの結果から、FIXとELISA表面上の抗体との適切な相互作用が、非特異的結合なしに確認されました。

GNP支援ELISAと従来のELISA：感度の決定

対照実験を行った後、GNP修飾表面でFIXを検出し、その結果を従来のELISA法と比較しました。 FIXの検出のために3つの異なる実験を実施しました。まず、GNPをAPTES修飾表面に固定化し、次に静電相互作用を介してFIXをGNPの表面に付着させました。静電相互作用により、ほとんどのタンパク質はGNP表面に結合する可能性があります。このようにして、ELISAPS表面にFIXを固定化することができます。タンパク質の固定化は、アミノ酸とGNPから生じる電荷にも依存します。 Gopinath etal。 [37]は、GNP表面でのFIXの強い結合を証明しており、高塩濃度条件下でも安定していることもわかりました。 2番目の方法では、GNPとタンパク質を最初に事前混合してから、アミノ化されたELISAPS表面に固定化しました。タンパク質分子が溶液状態でGNP表面に結合できる可能性が高いため、この方法で結合できるタンパク質が増えると予想されました。次に、予混合した溶液を、ＡＰＴＥＳ修飾アミン表面に固定化した。これらの方法を従来のELISA法と比較した。図5aに示すように、FIX濃度を0から200 nMまで滴定した場合、従来のELISA（方法1）では6nMの検出限界が示されました。 APTES-GNP-FIX法（方法2）は、200 pMの検出限界を示します。これは、従来のELISAと比較して30倍以上高い感度です。 ELISA PSプレートに固定化された多数の抗原を適切に配向させることで感度が向上し、最終的にはより多くの抗体が相互作用します。この研究では、ELISAプレートのアミン修飾により、金ナノ粒子を使用してより多くの抗原を固定化しました。従来のELISAでは、抗原はELISAプレートに直接固定化されているため、表面に結合する分子の数が少なくなり、現在の金ナノ粒子を介した戦略に比べて感度が低下します。さらに、GNPを用いた研究で明らかにされたように、局在表面プラズモン共鳴はさらなる感度の改善をもたらします。予想通り、GNPとFIXをプレミックスすると、検出限界が大幅に向上し、従来のELISAの60倍の感度である100pMのレベルに達しました。図5aに示すように、タンパク質の固定化にGNPを使用すると、GNP表面に事前混合および直接固定化されたタンパク質の両方で最大吸光度が約0.6に達しましたが、従来のELISAで検出された吸光度は約0.4でした。 FIXの同様の濃度（200 nM）。他の濃度でも、方法3は従来のELISAと比較して吸光度の差が大きく、これも方法2よりもかなり高かった。従来のELISAの場合、可視検出は25nMおよび3nMから見られた。方法2では、方法3では、吸光度が高いため、200 pMのFIXからの色の変化を視覚的に確認できました（図5a）。方法3では吸光度が25nMで飽和しました。200pMのFIXからの色の変化を視覚化できたため、検出限界を評価し、低濃度のFIXを使用して滴定しました。 GNPとFIXを事前に混合すると、検出限界が100 pMに達したことが明らかでした（図5b）。

a GNP修正ELISAにおけるFIXの感度を従来のELISAと比較する。 FIXは0.2から200nMまで滴定されました。従来のELISAは6nMの検出限界を示します。 GNP修飾ELISAでは、200pMまでシグナルが観察されました。図の挿入図は、視覚的な結果を示しています。 b GNP修飾ELISAプレートでのFIXの検出限界。 FIXは25から100pMまで滴定されました。検出限界は100pMであることがわかりました。図の挿入図は視覚的な結果を示しています

ヒト血清中のFIXの検出とFIXのスパイクによる強化

FIXは凝固カスケードにおいて重要な役割を果たすことがわかったため[38、39]、検出限界を確認した後、ヒト血清でもFIXを検出しました。この分析では、1：1280〜1：20希釈の範囲でヒト血清を滴定しました。上記のように、希釈した血清をGNPと事前に混合し、APTES修飾ELISA表面に固定化しました。 FIXが血清の1：640希釈から検出されたことは明らかであり、これは125 pM FIXに相当します（図6a）。健康なヒト血清には通常、アルブミンやグロブリンなどの他の主要なタンパク質とともに、約87nMのFIXが含まれています。私たちの戦略では、血液凝固障害の特定に役立つ、ヒト血清中の125pMという特定の検出限界に到達しました。一方、FIXを1から8 nMまでヒト血清の1：640希釈液にスパイクすると、吸光度の増加が見られ、それに伴ってFIX濃度が増加しました（図6b）。

a ヒト血清中のFIXの検出。ヒト血清を1:20から1：1280に希釈した。 FIXは1：640に希釈されたヒト血清で検出されました（内側の図は概略図を示しています）。 b FIX（0.125〜8 nM）をヒト血清の1：640希釈液にスパイクします。 FIX濃度の増加に伴い、吸光度が増加しました。図の挿入図は視覚的な結果を示しています

IDEサーフェスでのGNP-FIXの検出：相補性分析

GNP共役FIXは検出限界を改善することがわかったので、IDE表面を備えた電気化学センサーを使用して同様の戦略を適用し、これらの発見を補完しました。 FIXを25〜200 pM（GNPと混合）で滴定し、アミン修飾IDE表面に固定化してから、FIX抗体で検出しました。図7aに示すように、FIX濃度の増加に伴い、電流レベルもベースラインから同時に増加しました。 FIXレベルは200pMから飽和し、検出限界は25pMであることがわかりました。この検出は、ELISA（100 pM）と比較して4倍強化されています。さらに、FIX検出は希釈されたヒト血清で証明されました（図7b）。この実験では、ヒト血清を1:80から1：1280に希釈しました。図に示すように、1：1280（赤い曲線）の希釈は、3σ推定によるベースライン（黒​​い曲線）との明らかな違いを示し、1：1280の希釈によるヒト血清からのFIXの明らかな検出が一致することを示していますELISAの結果（1：640で検出）。希釈度の低いIDEからの検出では、感度の増加が示されます。

a Limit of detection of FIX-conjugated GNP on IDE sensing surface. FIX was titrated from 25 to 400 pM. The limit of detection was found to be 25 pM. b Detection of FIX in human serum on the IDE sensing surface. Human serum was diluted from 1:80 to 1:1280. FIX was detected in human serum diluted 1:1280

結論

Efficient immobilization of protein or antibody on the PS ELISA surface is a crucial step to improve the limit of detection. Here, we introduced a new and easy protein immobilization strategy on the PS ELISA surface assisted by GNPs. Two different methods were used:one is the direct immobilization of FIX on the GNP-modified surface, and another one is premixing of FIX with GNPs before attachment. It was found with the former method that improvement of the limit detection is 30-fold higher compared with the conventional ELISA. The latter method showed a 60-fold improved limit of detection compared to the conventional ELISA. We also demonstrated the detection of FIX in 1:650 diluted human serum, which is equivalent to 125 pM. Obviously, these strategies proved that the higher binding of proteins on the ELISA surface was able to improve the sensitivity and to be useful for detecting a wide range of biomarkers on the ELISA surface.

データと資料の可用性

All of the data are fully available without restriction.

略語

APTES：

（3-アミノプロピル）トリエトキシシラン

BSA：

ウシ血清アルブミン

COOH：

カルボン酸

ELISA：

酵素免疫測定法

Fc：

結晶化可能なフラグメント

GNP：

金ナノ粒子

HRP：

西洋ワサビペルオキシダーゼ

IDE:

Interdigitated electrode

IgG：

免疫グロブリン

OD：

光学密度

PEG：

ポリエチレングリコール

PS：

ポリスチレン

PVLA：

ポリビニルベンジルラクトノイルアミド

TMB：

3,3 '、5,5'-テトラメチルベンジジン