InVivoコンピューター断層撮影スキャンイメージング用の新しい造影剤としての生体適合性の高いAuNanocages @PEGナノ粒子の使用

はじめに

近年、コンピュータ断層撮影（CT）スキャンは、臨床現場で最も一般的に使用されている画像診断技術であり、さまざまな人間の組織の研究に広く適用されています。 CTスキャンの強力な透過性と高コントラスト能力および比較的単純な画像処理により、現代の医療システムで最も強力な非侵襲的画像診断技術と見なされています[1、2]。ただし、イメージングの過程では、病変といくつかの周囲の構造の間に自然なコントラストはありません。したがって、比較的高密度または低密度の物質である造影剤を使用して、標的構造または組織および器官を区別する必要があります。さらに、この物質はさまざまな組織でさまざまな吸収能力を持っており、軟組織でのX線照射によって観察することができます。 CTスキャンイメージングでのいくつかの分子といくつかの微粒子造影剤の使用が評価されています[3,4,5]。

現在、CTスキャンで最も一般的に使用されている造影剤は、ヨウ素を含む有機分子です。ヨウ化物イオンや非イオン性製剤などのヨウ素化分子は、臨床現場でのCTスキャンの造影剤として広く使用されています。ヨウ素化された分子は、良好なCTスキャンコントラスト強調を提供できますが、腎クリアランス速度が速く、体内循環時間が短く、アレルゲン特性があるため、以降のアプリケーションが大幅に制限されます[6、7]。ヨウ素現像液が急速に除去されるため、血液プールイメージングの有効な時間枠は大幅に制限され、高コントラストの画像を取得することは困難です。さらに、大量の薬物の急速なクリアランスは、腎臓に潜在的な副作用をもたらす可能性があります[8、9]。

過去10年間で、生物医学、特に画像診断におけるナノ粒子の応用がかなりの注目を集めてきました[10]。ヨウ素ベースの造影剤と比較して、ナノ粒子は、小分子が持たないコントラスト特性のペイロードを持ち、特定のサイズ、形状、および表面も持っています[11、12]。一般に、金、銀、その他の金属ナノ粒子など、原子番号の大きいナノ粒子は、優れたX線吸収係数を持っています。したがって、それらは顕著なコントラスト増強能力を持っています[13、14]。これらのナノ粒子の中で、金ナノ粒子は生物医学の分野で急速に開発されており、その重要な生物学的慣性と合成および表面修飾の容易さから、ヨウ素ベースの造影剤の代替品と見なされています[15、16、17]。金ナノ粒子は、ヨウ素化合物よりも血液循環時間が長く、腎毒性のリスクが低く、X線吸収係数が強い。したがって、投与量を減らすことができ、副作用のリスクは低くなります[18]。ナノスフェア、ナノロッド、ナノスターを含むいくつかの金ナノ粒子は、CTスキャンイメージングの造影剤として広く使用されており[19、20]、有望な効果があります。さまざまな金ナノ構造の中で、Auナノケージは中空の内部と薄い多孔質の壁を持っています。したがって、それらは、異なる形態を有する他の金ナノ粒子よりも高い表面積およびより効果的なCTスキャンイメージング能力を有する[21、22]。近年、Auナノケージは、光コヒーレンストモグラフィーおよび光音響トモグラフィーのコントラストエンハンサーとして使用されており、優れた性能を発揮することがわかっています。一方、Auナノケージの吸収面積が大きいため、光熱変換器としても効果的です[23、24]。私たちの知る限りでは、CTスキャンイメージングの造影剤としてのAuナノケージの使用を評価した研究はごくわずかです。上記の研究に基づいて、CTスキャン造影剤としてのAuナノケージの使用をさらに検討しました。 CTスキャンイメージングでのナノ粒子の適用には、生体適合性と生物活性を備えた表面が必要です。ポリエチレングリコール（PEG）は、生分解性および生体適合性のあるポリマーであり、RESによる捕捉を防ぎ、生体適合性、腎臓の除去能力、および血液循環時間を改善するために使用されるステルス材料でもあります。したがって、PEG化されたナノ粒子は長期間血中に保持される可能性があります[15、25、26、27、28]。

この研究では、新しいAuNC @ PEGが準備され、特性評価されました。次に、AuNC @ PEGのinvitro生体適合性を、MTT測色、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）漏出法、細胞内活性酸素種（ROS）濃度アッセイ、カルセイン-AM / PI、およびその他の実験手法によって評価しました。さらに、血液学的および組織学的分析を実施して、インビボでのAuNC @PEGの毒性を決定した。結果は、AuNC @PEGがinvitroおよびinvivoで優れた生体適合性を持っていることを示しました。さらに、AuNC @ PEGは、より強力なinvitroおよびinvivoCTスキャンイメージング能力を備えていることがわかりました。これらの実験結果は、合成されたAuNC @ PEGには、強いコントラスト、長い血液循環時間、腎毒性のリスクが低いなどの明らかな利点があることを示しています。したがって、この研究で合成された機能化されたAuNC @ PEGは、CTスキャンイメージングでの臨床応用に大きな可能性を秘めています。

メソッド

関連する詳細を含むすべての実験プロトコルは、中国の遼寧省にある錦州医科大学の地域倫理委員会によって承認されました。

材料と器具

LDHおよびROSテストキットは中国の南京生物工学研究所から購入し、カルセイン-AM / PI染色キットは中国のShanghaiDongren Chemical Technology Co.、Ltd。から購入しました。その他の化学薬品および溶媒はSigma-Aldrichから購入しました。すべてのセクションは、蛍光顕微鏡（DMI4000B、ライカ、ウェッツラー、ドイツ）を使用して評価されました。合成されたナノ粒子の特性は、透過型電子顕微鏡（TEM）で評価されました。 256列の512スライススパイラルCTスキャン（フィリップス、ドイツ）を使用し、イメージングパラメータは次のとおりでした。スライスの厚さ、0.625mm。管電圧、100 Kvp;管電流、100mA。

AuNC @PEGの合成

Auナノケージは、AgナノキューブとHAuCl ₄ の間の単純なガルバニック置換反応を使用して調製されました。 以前の研究[29、30]によると、解決策。通常、25 nmのAgナノキューブはジエチレングリコールで調製され、30nmのAuナノケージを合成するためのテンプレートとして使用されました。次に、SH-PEG（MW≈2000、5mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に溶解した10 mg）をAuNC溶液（pH 8.0、6.55 nM、6 mL）に加え、窒素下で暗所で一晩撹拌しました。保護。 AuNC @ PEGをさらに3回洗浄した後、水溶液に分散させました。

invitro毒性の評価

この研究では、MTT測色法、LDHリーク法、細胞内ROS濃度アッセイ、およびカルセイン-AM / PI染色を使用して、合成されたAuNC @PEGの毒性をinvitroで検出しました。 HUVEC細胞を1×10 ⁴ の密度で96ウェルプレートに接種しました。 /良い。 10％ウシ胎児血清とペニシリン（100μg/ mL）およびストレプトマイシンを添加したRPMI-1640培地を使用しました。次に、細胞を37℃および5％二酸化炭素インキュベーターで12時間培養しました。次に、さまざまな濃度（10、20、50、100、200、500、および1000μg/ mL）のAuNC @ PEGを含む培地を添加して、さらに培養しました。 24時間後、MTTアッセイが得られました。ナノ粒子を含まない培地を各グループのコントロールとして使用しました。

次に、異なる濃度のAuNC @ PEGで処理されたHUVEC細胞から放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）の含有量を測定して、invitroでの毒性を評価しました。細胞にMTTと同様に接種し、さまざまな濃度（10、20、50、100、200、500、および1000μg/ mL）のAuNC @PEGで24時間処理しました。次に、上清を分離し、遠心分離し、きれいな96ウェルプレートに移しました。培地中のLDHの活性は製造元の指示に従って評価され、吸光度は酵素標識装置（450 nm）を使用して決定されました。

ROSキットを使用して細胞内ROS濃度を測定する原理に基づいて、DCFHは2 '、7'-ジクロロフルオレセイン（DCFH-DA）の存在下で、強い緑色蛍光物質DCFであるジクロロフルオレセイン（DCF）に酸化されました。 HUVEC細胞を24ウェルプレートで12時間培養し、さまざまな濃度（50、100、200、および500μg/ mL）のAuNC @ PEGで24時間処理し、DCFH-DAと37°Cでインキュベートしました。 40分。過酸化水素で処理された細胞（H ₂ O ₂ ）を陽性対照として使用した。細胞の蛍光強度は、蛍光顕微鏡（λex、485 nm;λem、525 nm）を使用して観察されました。評価の前に、無血清および無氷の培地を3回使用して洗浄しました。

生/死染色では、HUVEC細胞を24ウェルプレートに接種し、12時間培養しました。次に、細胞をさまざまな濃度（10、20、50、100、200、500、および1000μg/ mL）のAuNC @PEGで24時間処理しました。遠心分離によりトリプシン-EDTAで消化した後、細胞をPBS（pH =7.4）で洗浄しました。次に、調製した細胞懸濁液を事前に設定したカルセイン-AM / PI試薬と混合し、37℃で15分間培養しました。 AuNC @ PEGの毒性を検出するために、死んだ細胞の数を蛍光顕微鏡で評価しました。

動物モデル

すべての動物実験手順は、遼寧医科大学の動物保護使用委員会によって確立された基準に従って実施されました。実験後、人道主義の原則に従って動物を安楽死させた。この研究では、体重250〜300gの成体SpragueDawleyラット（遼寧医科大学の動物センターから購入）を使用しました。この実験では、すべての動物をランダムにグループに分けました。抱水クロラール溶液（10 wt％）は腹腔を介して投与されました。次に、すべての材料が尾静脈から注入されました。

InVitroおよびInVivoCTスキャンイメージング

in vitro CTスキャンイメージングでは、さまざまな濃度のAuNC @ PEGとヨウ素溶液をEPチューブに入れ、適切な順序で配置し、CTスキャンを前から後ろに実行しました。インビボCTスキャンでは、麻酔を施した後、腹腔の中心を目印として、動物を頭から尾までスキャンしました。動物の位置は毎回変わらなかった。すべての元のデータ（0.625mmの画像）は、CTスキャンによる分析のためにフィリップスのワークステーションに送信されました。

InVivo毒性の評価

血液学的分析は、標準的な伏在静脈採血技術を使用して実施されました。ラットの心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓の組織を4％パラホルムアルデヒドで48時間固定し、脱水後にパラフィンに包埋しました。パラフィン切片の厚さは5μmで、スライドガラスにマウントしました。次に、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色を行い、顕微鏡下で分析を行いました。

統計分析

一元配置分散分析、および P を使用してデータを分析しました。 値はインデックスとして使用されました。 P SDの平均値で表されるように、値<0.05は統計的に有意であると見なされました。

結果と考察

AuNC @PEGの合成と特性評価

表面の機能化とサイズ制御は、高性能ナノ造影剤を開発するための2つの重要な要素です [ 15]。 AuNC @ PEGの構造と特性は、TEMとDLSによって決定されました。図1aは、AuNC @PEGのサイズが約40nmであり、均一性が高いという結果を示しています。一方、AuNC @ PEGの水和半径は、図1bに示すように、溶液中の分散をテストするためにも使用されました。AuNC@ PEGの水和半径は約50nmであり、AuNC @PEGが凝集することなく非常に安定していることを示しています。 。 AuNC @ PEGはサイズが小さく、生物学的慣性が比較的良好であるため、ナノメディシンアプリケーションに適しています。さらに、中空ケージ構造は、内部および外部固有の大きな表面積と優れたCTスキャンイメージング能力を示し、周囲の金属壁は、処理、輸送、および保管中にペイロードをさらに保護します。その明らかなコアシェル構造により、外側は生物学的適用性のPEGで覆われ、生体適合性を効果的に高め、マクロファージの捕獲を回避することができます。

AuNC @ PEGのTEM画像（ a ）およびAuNC @ PEGのDLS（ b ）

invitroでのAuNC @ PEGの安全性と安定性

インビボイメージングにAuNC @ PEGを使用する前に、それらの安全性と安定性を評価しました。 HUVEC細胞の生存率に対するAuNC @ PEGの影響は、MTTアッセイを使用して検出されました（図2a）。細胞をさまざまな濃度（10、20、50、100、200、500、および1000μg/ mL）のAuNC @PEGで24時間処理しました。 MTTアッセイの結果は、AuNC @ PEGの細胞生存率が対照群のそれと類似しており、AuNC @PEGの濃度が200μg/ mLに達したときに良好な生体適合性を示したことを示しました。 1000μg/ mLの濃度での細胞生存率は依然として> 75％でした。

異なるAuNC @ PEG濃度で24時間培養したHUVEC細胞の生存率のMTT評価（ a ）。 LDHを用いたAuNC @ PEGによって誘導された上清中の乳酸デヒドロゲナーゼの評価（ b ）。さまざまな濃度（H ₂ ）のAuNC @PEGで培養された細胞の24時間蛍光イメージングの検査 O ₂ （I）、0μg/ mL（II）、50μg/ mL（III）、100μg/ mL（IV）、200μg/ mL（V）および500μg/ mL（VI））、ROS法（ c ）。 * P <0.05、*** P <0.001。スケールバーは100μm

さらに、LDHアッセイは、invitroでのAuNC @ PEGの生体適合性を評価するためにも使用されました。正常な細胞では、LDHは細胞膜を通過することができません。細胞膜が損傷すると、LDHは細胞膜から放出されます [ 31]。したがって、細胞をさまざまな濃度のAuNC @ PEGで24時間処理することにより、細胞上清中のLDH含有量を測定することにより（図2b）、AuNC @PEGの安全性を評価しました。結果は、AuNC @PEGの濃度が<200μg/ mLの場合、細胞によって放出されるLDHレベルが非曝露対照細胞と比較してわずかに増加し、陽性対照群の濃度よりも有意に低いことを示しました（H ₂ O ₂ ）、これはMTTアッセイの結果と一致しており、最適濃度として200μg/ mLのAuNC @ PEGが良好な細胞適合性を示すことがわかりました。

さらに、酸化ストレス試験と生/死細胞免疫蛍光染色（カルセイン-AM / PI）の評価を実施して、AuNC @PEGの毒性をinvitroで検出しました。酸化ストレスはすべての生命システムにとって有害な状態であり、過剰な活性酸素種（ROS）は酸化ストレスを引き起こす可能性があります[32、33]。したがって、セル内のROSレベルを測定しました。異なる濃度のAuNC @ PEGによる24時間の誘導後、50〜200μg / mLの濃度で誘導された細胞の緑色蛍光強度は、対照群のそれと有意差はなく、それは対照群のそれよりも有意に低かった。陽性対照群（図2c）。蛍光強度はROSのレベルに比例していました。図3に示すように、0〜200μg / mLの濃度でのHUVEC細胞の生存率は> 90％でした（図3a〜f）。上記の結果は、200μg/ mLの濃度のAuNC @ PEGが安定しており、細胞適合性が良好であり、有望な臨床造影剤である可能性があることを検証しました。

生および死の染色の蛍光顕微鏡画像。さまざまな濃度（0μg/ mL（ a ）のAuNC @PEGで処理されたHUVEC細胞の生存率 ）、10μg/ mL（ b ）、20μg/ mL（ c ）、50μg/ mL（ d ）、100μg/ mL（ e ）、200μg/ mL（ f ）、500μg/ mL（ g ）、および1000μg/ mL（ h ））24時間。緑の蛍光は生細胞を表し、赤の蛍光は死細胞を表します。スケールバーは100μm

です

In VitroCTスキャンイメージングとCT値の決定

CTスキャンイメージングにおけるAuNC @ PEGの実現可能性を評価するために、さまざまなモル濃度（AuNC @ PEG）のコントラスト強調を造影剤（ヨウ素）の臨床使用と比較しました。 CTスキャン画像を取得し、CT値を測定しました。 AuNC @ PEGは、同様の濃度（50、100、200、500、および1000μg/ mL）のヨウ素造影剤と比較されました。結果は、CT値が濃度の増加とともに向上することを示し（図4a）、AuNC @ PEGとヨウ素造影剤のCT値の分析（図4b）によると、AuNC @PEGの吸収係数は次のようになりました。同様の濃度のヨウ素ベースの造影剤よりも優れており、CTスキャンイメージングにAuNC @PEGを使用する方が優れていることを示しています。

AuNC @PEGとヨウ素ベースの造影剤との間のinvitroでのコンピューター断層撮影スキャン所見の比較。濃度が高くなると、X線の減衰強度が高くなります（ a ）。 AuNC @ PEGとヨウ素ベースの造影剤（ b ）間のHu値の比較 ）。 *** P <0.001

In VivoCTスキャンイメージング

AuNC @ PEGのコントラスト能力が高いため、AuNC @PEGのイメージング品質をinvivoでのヨウ素剤のイメージング品質とさらに比較しました。 200マイクロリットルのAuNC @ PEG（200μg/ mL）をラットの尾静脈から注射しました。 AuNC @ PEGの血液プール血管造影の時間は、注射前（0分）および注射後の連続時点スキャン（10、20、30、40、60、および90分）によって評価されました。次に、対照群のラットに適切な濃度のヨウ素造影剤を注射した。注入量とスキャン時間はAuNC @ PEGと同様でした。造影剤の注入後、腎臓の造影剤の増強（図5）と膀胱の充満（SI図1）を同時に観察しました。結果は、AuNC @ PEGsグループの腎臓が30分でピークに達し、90分で完全に排泄され、ヨウ素ベースの造影剤グループで20分でピークに達し、60分で完全に排泄されることを示しました。その後、膀胱が時間の経過とともに徐々に造影剤で満たされることを観察しました。この発見は、AuNC @PEGの血液プール血管造影の時間がヨウ素ベースの造影剤のそれよりも優れていることを示した。 AuNC @ PEGの血液循環時間が長いほど、より良い診断が得られ、AuNC @PEGの開発の見通しが良くなります。

AuNC @PEGの注射後のさまざまな時点でのラットのinvivoCT画像

InVivoでのAuNC @ PEGの安全性

図6aに示すように、ルーチンの血液および肝臓と腎臓の機能分析の標準パラメーターは、ヘモグロビンレベル、平均赤血球ヘモグロビン濃度、平均赤血球容積、血小板数、赤血球数、白血球数、アルブミン濃度、アラニンアミノトランスフェラーゼレベル、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼレベル、およびクレアチニンレベル。統計分析では、AuNC @ PEG、ヨウ素造影剤、および対照群（ P ）の間に有意差は観察されませんでした。> 0.05）。さらに、AuNC @ PEG（200μg/ mL）の注射の24時間後に図6bに示すように、ラットの臓器（心臓、肝臓、脾臓、肺、および腎臓）を組織学的に分析しました。スライスされた;染色（H＆E）。対照群（ナノ材料を注入されていない）と比較して、顕微鏡下で示されるように、明らかな形態学的変化および損傷は見られなかった。上記の結果により、invivoでのAuNC @ PEGの安全性と信頼性がさらに確認されました。

AuNC @PEGのinvivo毒性評価。血液ルーチンおよび肝臓と腎臓の機能：ヘモグロビンレベル（I）、平均赤血球ヘモグロビン濃度（II）、平均赤血球容積（III）、血小板（IV）、赤血球数（V）、白血球数（VI）、アルブミン濃度（VII）、アラニンアミノトランスフェラーゼレベル（VIII）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼレベル（IX）、およびクレアチニンレベル（X）（ a ）。 H＆E染色は、正常ラットとAuNC @ PEGを24時間注射したラットの臓器（心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓）で実施しました（ b ）。 b のスケールバー 100μm

結論

サイズが小さく、コントラストが高く、血液の滞留時間が長く、毒性のリスクが低いなどの特徴を備えた、新しいタイプのCTスキャン造影剤であるAuNC @PEGを開発しました。インビトロおよびインビボ毒性評価は、AuNC @PEGが良好な生体適合性および副作用のリスクが低いことを示した。 invitroおよびinvivoでのCTスキャンのイメージング性能は、AuNC @PEGが従来のヨウ素ベースのイメージング剤よりも高いX線吸収係数と血液プール血管造影の長い時間を持っていることを示しました。さらに、AuNC @ PEGはヨウ素ベースの造影剤よりも優れており、AuNC @PEGの使用は実用的です。これらすべての結果は、AuNC @ PEGが従来のヨウ素ベースの造影剤よりも高いX線吸収係数を持ち、AuNC @PEGのイメージング性能が従来のヨウ素ベースの造影剤よりも高いことを示しました。したがって、この研究で合成された機能化されたAuNC @ PEGは、CTスキャンイメージングでの臨床応用に大きな可能性を秘めています。

データと資料の可用性

これらの調査結果を再現するために必要な生/処理済みデータは、現在進行中の研究開発の一部でもあるため、現時点では共有できません。

略語

CT：

コンピュータ断層撮影

DCF：

ジクロロフルオレセイン

DCFH：

ジクロロフルオレセイン

H ₂ O ₂ ：

過酸化水素

LDH：

乳酸デヒドロゲナーゼ

MTT：

3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド

PBS：

リン酸緩衝生理食塩水

PEG：

ポリエチレングリコール

ROS：

活性酸素種

TEM：

透過型電子顕微鏡