高生体適合性Auナノケージ@PEGナノ粒子：体内イメージングを強化する新規CT造影剤

概要

近年、造影剤は画像技術の品質向上のために広く使用されています。ナノ粒子は従来の分子スケールの造影剤よりも優れた体内検出能力を持っています。本研究では、強いX線吸収係数を持つ新しいタイプのAuナノケージ@PEGナノ粒子（AuNC@PEG）を合成し、コンピュータ断層撮影（CT）スキャン用の造影剤として評価しました。結果として、AuNC@PEGは良好な水分散性、低細胞毒性、強いX線吸収能力を示しました。さらに、体内実験では、合成されたAuNC@PEGが明確な造影効果、長い血中循環時間、および無視できるレベルの体内毒性を有することが示されました。したがって、本研究で合成された機能化AuNC@PEGは、CTスキャンイメージングにおける臨床応用への大きな可能性を秘めています。

はじめに

近年、コンピュータ断層撮影（CT）スキャンは臨床現場で最も一般的に使用されている診断画像技術であり、様々な人体組織の研究に広く応用されています。CTスキャンは強い透過力と高いコントラスト能力、比較的簡単な画像処理を備え、現代の医療システムにおいて最も強力な非侵襲的画像診断技術と見なされています[1, 2]。しかし、撮像過程において病変と周囲の一部構造の間に天然のコントラストがない場合があります。そのため、標的構造や組織・臓器を区別するために、比較的高密度または低密度の物質である造影剤を使用する必要があります。また、この物質は異なる組織で異なる吸収能力を持ち、軟部組織においてX線照射により観察可能です。CTスキャンイメージングにおいて、いくつかの分子および微粒子造影剤の使用が評価されてきました[3,4,5]。

現在、CTスキャンで最も一般的に使用されている造影剤はヨウ素を含む有機分子です。ヨード化分子（ヨウ化物イオンや非イオン性製剤など）は、臨床現場でCTスキャン用造影剤として広く使用されています。ヨード化分子は良好なCTスキャン造影効果を提供できますが、腎クリアランスが速く、体内循環時間が短く、アレルギー性があるため、さらなる応用が大きく制限されています[6, 7]。ヨード造影剤の急速な除去により、血管造影の有効なタイムウィンドウが著しく制限され、高コントラスト画像の取得が困難になります。さらに、大量の薬剤が急速にクリアランスされることで、腎臓に潜在的な副作用をもたらす可能性があります[8, 9]。

この10年間、ナノ粒子の生物医学への応用、特に診断イメージング分野が大きな注目を集めています[10]。ヨウ素系造影剤と比較して、ナノ粒子は小さな分子が持たない造影特性を備え、特定のサイズ、形状、表面を持っています[11, 12]。一般に、金、銀などの原子番号の大きい金属ナノ粒子は優れたX線吸収係数を持ち、顕著な造影増強能力を示します[13, 14]。これらの中で、金ナノ粒子は生物学的不活性が高く、合成と表面修飾が容易なため、生物医学分野で急速に発展し、ヨウ素系イメージング剤の代替と見なされています[15,16,17]。金ナノ粒子はヨウ素化合物よりも長い血中循環時間、低い腎毒性リスク、強いX線吸収係数を持ち、投与量を減らせ、副作用リスクが低いです[18]。ナノスフィア、ナノロッド、ナノスターなど、いくつかの金ナノ粒子がCTスキャン造影剤として広く使用され、有望な効果を示しています[19, 20]。様々な金ナノ構造の中で、Auナノケージは中空内部と薄い多孔性壁を持ち、他の形態の金ナノ粒子よりも大きな表面積とより効果的なCTスキャンイメージング能力を有します[21, 22]。近年、Auナノケージは光干渉断層撮影と光音響断層撮影の造影増強剤として使用され、良好な性能を示しています。また、Auナノケージの大きな吸収面積により、効果的な光熱トランスデューサーとしても機能します[23, 24]。私たちの知る限り、AuナノケージをCTスキャン造影剤として評価した研究はごくわずかです。上記の研究に基づき、本研究ではAuナノケージをCTスキャン造影剤としてさらに探求しました。CTスキャンイメージングへのナノ粒子応用には、生体適合性と生物学的活性を持つ表面が必要です。ポリエチレングリコール（PEG）は生分解性・生体適合性ポリマーであり、網内系（RES）による捕獲を防ぎ、生体適合性、腎排泄能力、血中循環時間を改善するステルス材料として用いられ、PEG化ナノ粒子は長期間血中に保持されます[15, 25,26,27,28]。

本研究では、新しいAuNC@PEGを調製・特性評価しました。次に、MTT法、乳酸脱水素酵素（LDH）漏出法、細胞内活性酸素種（ROS）濃度測定、Calcein-AM/PI染色などの実験手法により、AuNC@PEGの体外生体適合性を評価しました。さらに、血液学的および組織学的解析を行い、AuNC@PEGの体内毒性を判定しました。結果として、AuNC@PEGは優れた体外および体内生体適合性を示しました。また、AuNC@PEGは体外および体内でより強いCTスキャンイメージング能力を持つことが分かりました。これらの実験結果は、合成されたAuNC@PEGが強い造影効果、長い血中循環時間、低い腎毒性リスクなどの明確な利点を持つことを示しています。したがって、本研究で合成された機能化AuNC@PEGは、CTスキャンイメージングにおける臨床応用への大きな可能性を秘めています。

方法

関連する詳細を含むすべての実験プロトコルは、中国遼寧省の錦州医科大学地域倫理委員会によって承認されました。

材料と機器

LDHおよびROS試験キットは中国南京市の南京生物工学研究所から、Calcein-AM/PI染色キットは中国上海市の上海東仁化学技術有限公司から購入しました。その他の化学試薬と溶媒はSigma-Aldrichから購入しました。すべての切片は蛍光顕微鏡（DMI4000B、Leica、Wetzlar、Germany）で評価しました。合成ナノ粒子の特性は透過型電子顕微鏡（TEM）で評価しました。256列512スライス螺旋CTスキャン（Philips、Germany）を使用し、撮像パラメータは以下の通りです：スライス厚0.625 mm、管電圧100 kVp、管電流100 mA。

AuNC@PEGの合成

Auナノケージは、AgナノキューブとHAuCl₄溶液との間の単純な置換反応により、先行研究に従って調製しました[29, 30]。典型的には、ジエチレングリコール中で25 nmのAgナノキューブを調製し、30 nmのAuナノケージ合成のテンプレートとして使用しました。次に、SH-PEG（分子量≈2000、10 mgを5 mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に溶解）をAuNC溶液（pH 8.0、6.55 nM、6 mL）に加え、窒素雰囲気下で暗所にて一晩攪拌しました。AuNC@PEGをさらに3回洗浄後、水溶液中に分散させました。

体外毒性の評価

本研究では、MTT法、LDH漏出法、細胞内ROS濃度測定、Calcein-AM/PI染色を用いて、合成AuNC@PEGの体外毒性を検出しました。HUVEC細胞を1×10⁴/wellの密度で96ウェルプレートに播種しました。10%胎仔牛血清、ペニシリン（100 μg/mL）、ストレプトマイシンを補充したRPMI-1640培地を使用しました。細胞を37℃、5%二酸化炭素インキュベーターで12時間培養しました。その後、異なる濃度（10、20、50、100、200、500、1000 μg/mL）のAuNC@PEGを含む培地を添加し、さらに培養しました。24時間後、MTTアッセイを行いました。ナノ粒子を含まない培地を各群の対照としました。

次に、異なる濃度のAuNC@PEGで処理したHUVEC細胞から放出される乳酸脱水素酵素（LDH）の含量を測定し、体外毒性を評価しました。細胞はMTT法と同様に播種し、異なる濃度（10、20、50、100、200、500、1000 μg/mL）のAuNC@PEGで24時間処理しました。その後、上清を分離、遠心分離し、清潔な96ウェルプレートに移しました。培地中のLDH活性を製造元の指示に従って評価し、酵素標識装置（450 nm）で吸光度を測定しました。

ROSキットを用いた細胞内ROS濃度測定の原理に基づき、2',7'-ジクロロフルオレセイン（DCFH-DA）の存在下でDCFHがジクロロフルオレセイン（DCF）に酸化され、強い緑色蛍光物質DCFとなります。HUVEC細胞を24ウェルプレートで12時間培養し、異なる濃度（50、100、200、500 μg/mL）のAuNC@PEGで24時間処理し、37℃で40分間DCFH-DAとインキュベートしました。過酸化水素（H₂O₂）で処理した細胞を陽性対照としました。蛍光顕微鏡（λex、485 nm；λem、525 nm）で細胞の蛍光強度を観察しました。評価前に、血清および氷フリー培地で3回洗浄しました。

生死染色では、HUVEC細胞を24ウェルプレートに播種し、12時間培養しました。その後、異なる濃度（10、20、50、100、200、500、1000 μg/mL）のAuNC@PEGで24時間処理しました。トリプシン-EDTAで消化後、遠心分離し、PBS（pH=7.4）で洗浄しました。調製した細胞懸濁液を予め調製したCalcein-AM/PI試薬と混合し、37℃で15分間培養しました。AuNC@PEGの毒性を検出するため、蛍光顕微鏡で死細胞数を評価しました。

動物モデル

すべての動物実験手順は、錦州医科大学動物保護および使用委員会が定めた基準に従って実施しました。実験後、動物は人道的原則に従って安楽死させました。本研究では、体重250–300 gの成熟スプラーグ・ドーリー系ラット（錦州医科大学動物センター購入）を使用しました。すべての動物をランダムに群分けしました。クロラール水和物溶液（10 wt%）を腹腔投与し、すべての材料を尾静脈から投与しました。

体外および体内CTスキャンイメージング

体外CTスキャンイメージングでは、異なる濃度のAuNC@PEGとヨウ素溶液をEPチューブに入れ、適切な順序で配置し、前面から背面へCTスキャンを実施しました。体内CTスキャンでは、麻酔投与後、腹腔中心をランドマークとして頭部から尾部へスキャンしました。動物の位置は毎回変更しませんでした。すべての元データ（0.625 mm画像）をPhilipsワークステーションに転送し、CTスキャンにより解析しました。

体内毒性の評価

血液学的解析は標準的な伏在静脈採血法で実施しました。ラットの心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓の組織を4%パラホルムアルデヒドで48時間固定し、脱水後パラフィン包埋しました。パラフィン切片を5 μm厚で作製し、ガラススライドに載せました。ヘマトキシリン・エオシン（H&E）染色を行い、顕微鏡下で解析しました。

統計解析

データは一元配置分散分析で解析し、P値を指標としました。P値＜0.05を統計的に有意とし、平均値±SDで表しました。

結果と考察

AuNC@PEGの合成と特性評価

表面機能化とサイズ制御は、高性能ナノ造影剤開発の2つの鍵となる要因です[15]。AuNC@PEGの構造と特性はTEMとDLSで決定しました。図1aに示すように、AuNC@PEGのサイズは約40 nmで高い均一性を示しました。一方、AuNC@PEGの水和半径も溶液中での分散性をテストするために使用され、図1bに示すように約50 nmであり、AuNC@PEGが凝集なく非常に安定であることを示しています。AuNC@PEGはより小さなサイズと比較的良好な生物学的不活性を持ち、ナノ医薬品応用に適しています。さらに、中空ケージ構造は大きな内外比表面積と優れたCTスキャンイメージング能力を示し、周囲の金属壁が処理、輸送、保存中のペイロードに追加の保護を提供します。明確なコア-シェル構造を持ち、外側が生物学的適用可能なPEGで覆われているため、生体適合性を効果的に高め、マクロファージによる捕獲を回避できます。

AuNC@PEGのTEM画像（a）とDLS測定結果（b）

AuNC@PEGの体外安全性と安定性

AuNC@PEGを体内イメージングに使用する前に、その安全性と安定性を評価しました。MTT法を用いてAuNC@PEGがHUVEC細胞の生存率に与える影響を検出しました（図2a）。細胞を異なる濃度（10、20、50、100、200、500、1000 μg/mL）のAuNC@PEGで24時間処理しました。MTTアッセイの結果、AuNC@PEGの細胞生存率は対照群と同様であり、濃度200 μg/mLまで良好な生体適合性を示しました。濃度1000 μg/mLでも細胞生存率は75%以上を維持しました。

異なる濃度のAuNC@PEGで24時間培養したHUVEC細胞のMTTによる生存率評価（a）。LDHによるAuNC@PEG誘導上清中乳酸脱水素酵素評価（b）。異なる濃度のAuNC@PEGで24時間培養した細胞のROS法による蛍光イメージング（H₂O₂（I）、0 μg/mL（II）、50 μg/mL（III）、100 μg/mL（IV）、200 μg/mL（V）、500 μg/mL（VI））（c）。*P＜0.05、***P＜0.001。スケールバーは100 μm

さらに、LDHアッセイもAuNC@PEGの体外生体適合性評価に用いました。正常細胞ではLDHは細胞膜を通過しません。細胞膜が損傷すると、LDHが細胞膜を通過して放出されます[31]。したがって、異なる濃度のAuNC@PEGで24時間処理した細胞の上清中LDH含量を測定し、安全性を評価しました（図2b）。結果として、AuNC@PEG濃度が200 μg/mL未満では、非暴露対照細胞と比較して細胞から放出されるLDHレベルがわずかに増加し、陽性対照群（H₂O₂）より有意に低く、MTTアッセイの結果と一致しました。200 μg/mLのAuNC@PEGが良好な細胞適合性を持つ最適濃度であることが分かりました。

さらに、酸化ストレス試験と生死細胞免疫蛍光染色（Calcein-AM/PI）を実施し、AuNC@PEGの体外毒性を検出しました。酸化ストレスはすべての生命システムに有害な状態であり、過剰な活性酸素種（ROS）は酸化ストレスを引き起こします[32, 33]。したがって、細胞内ROSレベルを測定しました。異なる濃度のAuNC@PEGで24時間誘導後、50–200 μg/mL濃度で誘導された細胞の緑色蛍光強度は対照群と有意に差がなく、陽性対照群より有意に低かったです（図2c）。蛍光強度はROSレベルに比例します。図3に示すように、0–200 μg/mL濃度でのHUVEC細胞生存率は90%以上でした（図3a–f）。以上の結果は、200 μg/mL濃度のAuNC@PEGが安定で良好な細胞適合性を持ち、有望な臨床造影剤となり得ることを検証しました。

生死染色の蛍光顕微鏡画像。異なる濃度のAuNC@PEGで24時間処理したHUVEC細胞の生存率（0 μg/mL（a）、10 μg/mL（b）、20 μg/mL（c）、50 μg/mL（d）、100 μg/mL（e）、200 μg/mL（f）、500 μg/mL（g）、1000 μg/mL（h））。緑色蛍光は生細胞、赤色蛍光は死細胞を示す。スケールバーは100 μm

体外CTスキャンイメージングとCT値の決定

AuNC@PEGのCTスキャンイメージングへの実現可能性を評価するため、異なるモル濃度のAuNC@PEGと臨床用造影剤（ヨウ素）の造影増強を比較しました。CTスキャン画像を取得し、CT値を測定しました。AuNC@PEGをヨウ素造影剤と類似濃度（50、100、200、500、1000 μg/mL）で比較しました。結果として、濃度の増加に伴いCT値が増強されました（図4a）。AuNC@PEGとヨウ素造影剤のCT値解析（図4b）によると、類似濃度においてAuNC@PEGの吸収係数はヨウ素系造影剤より優れており、AuNC@PEGをCTスキャンイメージングに使用する方が優れていることが示されました。

AuNC@PEGとヨウ素系造影剤の体外CTスキャン所見比較。濃度増加に伴いX線減衰強度が増加（a）。AuNC@PEGとヨウ素系造影剤のHU値比較（b）。***P＜0.001

体内CTスキャンイメージング

AuNC@PEGの高い造影能力により、体内でのAuNC@PEGとヨウ素剤のイメージング品質をさらに比較しました。AuNC@PEG（200 μg/mL）200 μLをラットの尾静脈から注射しました。AuNC@PEGの血管造影時間を、注射前（0分）と注射後の連続タイムポイント（10、20、30、40、60、90分）でスキャンし評価しました。対照群のラットには適切な濃度のヨウ素造影剤を注射しました。投与量とスキャン時間はAuNC@PEGと同様にしました。造影剤注射後、腎臓の造影増強（図5）と膀胱への充填（補足図1）を同時に観察しました。結果として、AuNC@PEG群の腎臓は30分でピークに達し、90分で完全に排泄されたのに対し、ヨウ素系造影剤群では20分でピークに達し、60分で完全に排泄されました。その後、膀胱が時間経過とともに徐々に造影剤で充填されることを観察しました。この所見は、AuNC@PEGの血管造影時間がヨウ素系造影剤より優れていることを示しています。AuNC@PEGのより長い血中循環時間はより良い診断を可能にし、AuNC@PEGはより良い開発見込みを持っています。

AuNC@PEG注射後の様々なタイムポイントにおけるラットの体内CT画像

AuNC@PEGの体内安全性

図6aに示すように、定期的な血液および肝臓・腎臓機能解析の標準パラメータは、ヘモグロビンレベル、平均赤血球ヘモグロビン濃度、平均赤血球容積、血小板数、赤血球数、白血球数、アルブミン濃度、アラニンアミノトランスフェラーゼレベル、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼレベル、クレアチニンレベルによって反映されました。統計解析では、AuNC@PEG群、ヨウ素造影剤群、対照群の間に有意差は認められませんでした（P＞0.05）。さらに、ラットの臓器（心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓）を組織学的に解析しました（図6b）。AuNC@PEG（200 μg/mL）注射24時間後、切片を作製し、H&E染色を行いました。対照群（ナノマテリアル非投与）と比較して、顕微鏡下では明らかな形態学的変化や損傷は認められませんでした。以上の結果は、AuNC@PEGの体内での安全性と信頼性をさらに確認するものです。

AuNC@PEGの体内毒性評価。血液常規および肝・腎機能：ヘモグロビンレベル（I）、平均赤血球ヘモグロビン濃度（II）、平均赤血球容積（III）、血小板（IV）、赤血球数（V）、白血球数（VI）、アルブミン濃度（VII）、アラニンアミノトランスフェラーゼレベル（VIII）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼレベル（IX）、クレアチニンレベル（X）（a）。正常ラットおよびAuNC@PEG投与24時間後のラットの臓器（心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓）でH&E染色を実施（b）。bのスケールバーは100 μm

結論

本研究では、小型サイズ、高造影、長い血中保持時間、低毒性リスクといった特性を持つ新しいタイプのCTスキャン造影剤であるAuNC@PEGを開発しました。体外および体内毒性評価により、AuNC@PEGが良好な生体適合性と低い副作用リスクを持つことが示されました。体外および体内でのCTスキャンイメージング性能により、AuNC@PEGは従来のヨウ素系イメージング剤よりも高いX線吸収係数と長い血管造影時間を有することが示されました。さらに、AuNC@PEGはヨウ素系イメージング剤より優れており、実用的です。これらすべての結果は、AuNC@PEGが従来のヨウ素系造影剤より高いX線吸収係数を持ち、イメージング性能が優れていることを示しています。したがって、本研究で合成された機能化AuNC@PEGは、CTスキャンイメージングにおける臨床応用への大きな可能性を秘めています。

データおよび資料の入手可能性

これらの知見を再現するために必要な生データ/処理済みデータは、現在進行中の研究開発の一部でもあるため、現時点では共有できません。

略語

CT:

コンピュータ断層撮影

DCF:

ジクロロフルオレセイン

DCFH:

ジクロロフルオレシン

H₂O₂:

過酸化水素

LDH:

乳酸脱水素酵素

MTT:

3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド

PBS:

リン酸緩衝生理食塩水

PEG:

ポリエチレングリコール

ROS:

活性酸素種

TEM:

透過型電子顕微鏡