ドキソルビシンの標的化送達のための抗Epcamアプタマー（Syl3c）-機能化リポソーム：C26結腸癌を有するマウスにおけるinvitroおよびinvivo抗腫瘍研究

はじめに

100〜200 nmのサイズのナノドラッグデリバリーシステム（NDDS）は、強化された透過性と保持（EPR）効果を介して腫瘍微小環境に受動的に蓄積されます。これは、内皮の裏打ちが緩く、リンパ液の排出が弱いことで起こります。しかし、最近のデータによると、投与された薬剤の1％未満しか腫瘍部位に到達できませんでした[1]。腫瘍の高密度の細胞外マトリックス（ECM）に浸透する能力の欠如、放出された薬物の循環への復帰、および腫瘍の不均一性が、この失敗の原因です[2]。内因性および外因性の刺激を使用してNDDSの腫瘍蓄積を改善するためにさまざまな戦略が使用されてきました[3]。これらのNDDSは、光などの外因性刺激に応答する可能性があり、腫瘍イメージングで使用する能力があります[4]。抗がん剤として使用する能力を持つ多くの異なる無機ナノ材料があります[5、6]。ただし、無機ナノ材料の場合は、その毒性と環境の安全性に注意を払う必要があります[7、8、9、10、11]。

アクティブな標的化送達は、NDDSが治療薬を腫瘍により効率的に送達し、非標的組織への曝露を最小限に抑えるのに役立つ重要なアプローチです[12、13]。標的化送達のための理想的な標的化剤は、特定の細胞または組織成分によってアップレギュレーションされる細胞表面タンパク質または受容体に親和性を有する分子です[14]。

上皮細胞接着分子（EpCAM）は、アクティブターゲティングの候補リガンドと見なされる膜貫通型糖タンパク質です。最近の発見は、EpCAMが正常な低発現の健康な上皮細胞を持っているのに対し、癌細胞ではその発現がより高いレベル（最大1000倍）になることを示しました[15、16、17]。癌の発生中に、EpCAMの発現パターンは正常上皮の基底膜および基底外側膜から腫瘍上皮細胞の頂端表面に変化します[18]。この差次的発現により、EpCAMは薬物送達の非常に興味深いリガンドとなり、薬物の治療指数を改善する可能性があります[19]。

EpCAMは、癌幹細胞（CSC）または腫瘍開始細胞（TIC）マーカーとして示され、癌での発現は予後不良に関連しています[20]。 CSCまたはTICは、自己複製、同じタイプの細胞をより多く産生する能力を持ち、腫瘍の発生と転移に重要な役割を果たす細胞です[21]。 EpCAMの過剰発現は、さまざまな固形腫瘍のCSCで報告されています[22]。最近、アプタマーは広範囲の調査で大きな注目を集めており、NDDSでターゲティングリガンドとして使用できる潜在的に強力な分子として浮上しています[23、24]。アプタマーは、細胞表面受容体などの標的に親和性のある二次および三次構造を持つDNAまたはRNAベースのオリゴヌクレオチド配列です[23、24]。アプタマーには、たとえば、免疫原性がなく、化学的および熱的安定性を備えた低分子量（8〜25 kDa）であるなど、いくつかの利点もあります。さらに、それらの合成と化学修飾は低コストでスケーラブルです[25]。抗EpCAM特異的アプタマーを介したNDDSの選択的ターゲティングは、化学療法剤を腫瘍微小環境に送達するための効果的なターゲティングオプションと見なすことができます[19、26]。この点に関して、さまざまな研究により、抗EpCAMアプタマーで機能化されたナノキャリアが腫瘍細胞への抗がん剤の送達を効果的に改善できることが示されました[15、27、28]。

この研究の目的は、NDDSのモデルとしてドキソルビシン（DOX）（ED-lip）をロードした抗EpCAM DNAアプタマー（SYL3C）-PEG化ナノリポソームを開発することです。このような官能基化は、アプタマーのアミン基とDSPE-mPEG ₂₀₀₀ のカルボキシル基の間のEDC / NHSカップリング化学によって実行されました。 、図1に示すように、リポソームに後挿入されます。EDリップは、サイズ、ゼータ電位、およびドキソルビシンカプセル化の割合、放出プロファイル、および細胞毒性について特徴付けられます。次に、これらのED-lipがin vitroで細胞の取り込みを改善し、C26結腸癌腫瘍を有するマウスを標的としてDOXを腫瘍に送達できるかどうかを評価しました。

抗EpCAM機能化Caelyx®（ED-lip）の調製。 a 抗EpCAMアプタマーのDSPE-mPEG ₂₀₀₀ へのリンク 抗EpCAMアプタマーの第一級アミン（-NH2）がDSPE-mPEG ₂₀₀₀ のカルボキシル基（-COOH）に共有結合することにより 。 b 抗EpCAM機能化Caelyx®（ED-lip）を調製するための挿入後の方法

結果と考察

Caelyx®、PEG化リポソームドキソルビシンは、最も広く使用されている化学療法剤の1つであり、卵巣癌、AIDS関連カポジ肉腫および多発性骨髄腫の治療に適応された最初のFDA承認ナノ粒子です。 Caelyx®はEPR効果を介して腫瘍部位に受動的に浸透しました[29]。ただし、Caelyx®はDOXの薬物動態と半減期を大幅に改善しました。ただし、Caelyx®の主な制限は、細胞への取り込みが不十分であり、腫瘍部位での薬物の放出速度が遅いことです[29]。ここでは、SYL3Cアプタマーをターゲティングリガンドとして使用して、リポソームドキソルビシン（ED-lip）を機能化し、癌細胞の表面にあるEpCAM分子をターゲティングします。これにより、アクティブなターゲティングのプロセスを通じて特定の標的部位にDOXを送達できます。

DSPE-mPEG ₂₀₀₀ の活用 アプタマーへ

本研究では、アミン官能化抗EpCAMアプタマーをDSPE-mPEG ₂₀₀₀ の活性カルボン酸基に結合させるために、EDC / NHSカップリング化学を使用しました。 -COOH。 EDC / NHSカップリング化学とアミド結合の形成を使用したこのカップリング反応の利点は、その安定性とアプタマー間の非特異的相互作用の低減です[30]。アプタマーは、一級アミンまたはチオール基で修飾し、共有結合させて、それぞれマレイミドのカルボキシル基またはピロール基を活性化することができます[31]。チオール基で修飾されたアプタマーは、DSPE-PEG ₂₀₀₀ のマレイミド官能基に結合しました。 。次に、DSPE-PEG ₂₀₀₀ -リポソームの外面を装飾するためにリポソーム構造に後挿入されたアプタマー[32]。マレイミドチオール化学の重要な制限の1つは、保存中にアプタマーのチオール基が酸化の影響を受け、2つのチオール修飾アプタマー間にジスルフィド結合（S-S）が形成される可能性があることです。これらの二量体アプタマーは、DSPE-PEG ₂₀₀₀ のマレイミド官能基との共役反応に参加できません。 [30]。したがって、EDC / NHS反応を使用すると、生成物の収率が向上し、挿入後の方法が向上します。

アプタマーには、合成とスケールアップの容易さ、全身毒性の低さ、免疫原性の欠如など、抗体に比べていくつかの利点があります[33]。ここでは、脂質へのアプタマー結合後、挿入後の方法を採用して、抗EpCAMアプタマーで装飾されたCaelyx®（ED-lip）を作成しました。一般に、挿入後の技術は、リポソームの表面にアプタマーを付着させるための単純で効果的な方法であり、リポソームへのより高い割合のアプタマーの取り込みを提供した[34]。

リポソームへの抗EpCAMアプタマーの挿入後の評価にゲル電気泳動移動度シフトアッセイを使用しました。図2に示すように、負に帯電したアプタマーはゲル内を移動し、ED-lipがウェルラインにトラップされてゲル内を移動できなかったため、ED-lip製剤の対応するバンドがないときにそれらのバンドが観察されました。これらの結果は、アプタマー結合ミセルがリポソームの表面に正常に後挿入されたことを示しています。

アガロースゲル-ED-lip製剤の電気泳動。サンプルをアガロースゲルにロードします。紫外線がゲルを可視化しました。ラダー、フリーアプタマーおよびPLコンジュゲートアプタマーに対応するウェルが示されています。リポソーム-アプタマーの対応するバンドの欠如は、挿入後の確認を示しました

ED-lipの物理化学的特性評価

Caelyx®とED-lipの物理化学的特性を表1に示しました。調製した製剤のサイズと電荷により、Caelyx®を抗EpCAMアプタマーで修飾しても粒子サイズに有意な影響がないことがわかりました（ p >> 0.05）。アプタマー（Caelyx®）の挿入前のリポソームサイズは約96 nm、PDIは0.11でした。挿入後（ED-lip）後、リポソームのサイズは部分的に117 nmに増加し、PDIは0.14で、腫瘍。以前の研究の結果はまた、標的リガンドの組み込みがリポソームのサイズおよびPDIの増加につながることを示した[35、36]。さらに、ED-lipのゼータ電位（-19.25）は、Caelyx®（-12）よりも負になりました。リポソームへのRNA-アプタマー結合は、リポソームのゼータ電位の低下をもたらすことが示された[37]。 ED-lipのサイズの増加と負のゼータ電位は、リポソームの表面への結合アプタマーの挿入後の成功の証拠である可能性があります[38]。これらの結果は、Caelyx®の表面へのアプタマーの付着が粒子サイズのわずかな増加とアプタマー機能化Caelyx®のより負のゼータ電位につながることを示した以前の研究と一致しています[38、39]。ただし、挿入後の有効性は、インキュベーション時間と温度の観点からテストして、より良いサイズとPDIを備えたより効率的な挿入後のリポソームに到達する必要があります。 Caelyx®とED-lipのカプセル化効率は100％でした（表1を参照）。

リポソームの表面に後挿入されたアプタマーの数は、記載されているように決定された[6]。リン酸アッセイによって決定されたリポソーム製剤のリン脂質含有量の総量は14mMであった。なぜなら、平均サイズ100nmのリポソーム中の脂質分子の平均数は8×10 ⁴ 1ミリリットルあたりのリポソームの数はほぼ10 ¹⁴ [38]。アプタマーの分子量はg / molでした。 DSPE-mPEG ₂₀₀₀ の数 -アプタマーは、リン酸分子のモルが共役分子のモルに対応するリン酸アッセイ法に基づいて決定されました。これらのデータに基づくと、各mlアリコート溶液あたりのアプタマー分子の数は10 ¹⁵ です。 。

DOXリリースプロファイル

Caelyx®の外面へのアプタマー結合ミセルの挿入は、DOXの放出プロファイルに影響を与える可能性があります。したがって、50％FBSを含む5％デキストロースでのCaelyx®と比較したDOXフォームED-lipの放出を評価しました。この媒体は、血漿中の製剤の放出挙動を模倣する可能性があります[40]。図3は、24時間の研究中にCaelyx®およびED-lip製剤からのDOX放出に有意差がなく、ごくわずかな量のDOXのみが放出されたことを示しています。これは、リポソームの表面へのアプタマーの挿入がDOXの膜の安定性と放出プロファイルに影響を与えなかったことを示した以前の研究と一致しています[38、39]。これは主に、pH勾配駆動のリモートローディング法を使用して製剤化されたCaelyx®製剤の安定性によるものです[41]。

リリース調査。 24時間の研究中のデキストロース中の50％FBSの存在下での37°CでのCaelyx®およびED-lipからのDOX含有量漏出プロファイル。平均±標準偏差（SEM）として表されるデータ（ n =3）

蛍光顕微鏡による細胞相互作用と細胞取り込み

リポソーム製剤の細胞相互作用と細胞取り込みを4°Cと37°Cで評価し、図4に示しました。ED-lipのターゲティング効果の評価は、平均蛍光強度（MFI）間に差がないことを示しました。 Caelyx®およびED-lipで4°Cおよび37°Cで処理されたCHO-K1細胞の分析（図4a、c）。ただし、データは、ターゲットED-lipが4°および37°CでCaelyx®と比較してC26細胞による取り込みがかなり高く（図4b、d）、37°C​​で統計的に有意であることを示しました（ p <0.0001）。 EDリップはCaelyx®（ p ）と比較して有意な取り込みがありました <0.001）。これらの結果は、抗EpCAMアプタマーによるED-lip増強標的特異性が、CHO-K1細胞と比較してC26細胞株に対してより親和性があることを示した。遊離DOXは脂質二重層を自由に通過して細胞に入るため、製剤の中で細胞への取り込みが最も高く、したがって細胞毒性が最も高くなります。 Caelyx®の場合、PEG化はエンドサイトーシスの速度を制限し、細胞毒性の低下をもたらしました。ただし、リポソーム（ED-lip）の表面に抗EpCAMアプタマーが存在すると、細胞への製剤の内在化の速度が高まり、Caelyx®と比較して細胞毒性が高まります[38]。蛍光顕微鏡のデータは、37°C​​でのC26細胞株におけるED-lipと遊離DOXの細胞取り込みの違いが有意ではないことを示しました（図5）。ただし、ED-lipとDOXの両方がC26細胞取り込みにおいてCaelyx®と統計的に有意な差を示している表2に示されている内部移行DOXの強度に基づくスケーリング（ p <0.001）。 C26細胞はその表面に低レベルのEpCAMを発現しますが[42]、この研究のデータは、抗EpCAMアプタマーの存在がリポソームの内在化プロセスの速度を高める可能性があることを示唆しました[43]。

4°Cおよび37°Cで評価されたリポソーム製剤の細胞相互作用および細胞取り込み。 a 4°Cおよび37°Cでの製剤のCHO-K1細胞相互作用。 b 4°Cおよび37°Cでの製剤とC26細胞との相互作用。 c グラフは、CHO-K1およびC26細胞での製剤の平均MFIを示しています。平均±標準偏差（SEM）として表されるデータ（ n =3）。 **** p <0.0001

蛍光顕微鏡。蛍光顕微鏡によって視覚化されたC26細胞株上のDOXの細胞内在化の結果。 DAPIで染色された細胞。無料のDOXとED-lipはどちらも、Caelyx®と比較してDOXの内部移行のレベルが高くなっています。倍率200倍で検査された細胞

細胞毒性研究

遊離DOX、Caelyx®、およびED-lip製剤の細胞毒性効果を図6に示します。細胞を1、3、および6時間処​​理し、次の72時間インキュベートするために使用されるさまざまな濃度の製剤。データは、すべての製剤が時間と用量に依存して細胞に影響を与えることを示しました。 ED-lip製剤で処理されたC26細胞の生存率は、Caelyx®で処理された細胞と比較して減少しました。 CHO-K1細胞はEpCAM陰性細胞として、C26細胞と比較してED-lipに対する応答が低いため、抗EpCAMアプタマーは標的細胞へのCaelyx®の特異的送達を増加させたようです。これらの結果は、C26細胞によるED-lipの特定の細胞取り込みを確認することができます。これらの結果は、標的外を回避することによって薬物の副作用を低減しながら、標的細胞への薬物の選択的送達に対する特定の標的薬剤による標的化薬物送達の使用の重要性を強調した[44]。以前に報告されたように、アプタマーや抗体などの特定のターゲティングリガンドによるCaelyx®のアクティブなターゲティングにより、アクティブな腫瘍ターゲティングと標的細胞への特異的な薬物送達が増加し、DOXの治療効果が向上しました[35、39]。

異なる曝露時間後のCHO細胞およびC26細胞に対するED-lip、Caelyx®、および遊離ドキソルビシンのinvitro細胞毒性効果（IC50）。 μg/ ml±標準偏差（SEM）として表されるデータ（ n =3）。 * p <0.05、** p <0.01、*** p <0.001、**** p <0.0001

生体内分布と薬物動態

抗EpCAMアプタマーがDOXの生体内分布にどのように影響するかを評価するために、皮下C26結腸癌腫瘍を有するマウスに10 mg / kgのED-lipとCaelyx®を注射しました。 Caelyx®とED-lipを注射してから3、12、24、48、72時間後の血漿中のDOX濃度を図7に示します。結果は、両方のグループの血漿DOX濃度の挙動が類似しており、両方の製剤間に有意差はありませんでした。表3に示すように、抗EpCAMアプタマーのリポソーム表面への結合は、循環半減期を39.3時間から34.2時間に、MRTを47.6時間から42.9時間にわずかに減少させました（表3を参照）。薬物動態パラメータは、リポソームへの抗EpCAMアプタマーの結合がt _½をわずかに減少させたことを示した。 以前の報告と一致したMRTは、リポソーム表面へのアプタマーの結合がリポソームのクリアランスを加速することを示しました[38]。タンパク質の吸着とその結果としての単核貪食系（MPS）による除去は、リガンド結合ナノ粒子の血液クリアランスの加速の理由である可能性があります[45]。

DOXの血漿レベル。注射後3、12、24、48、および72時間での血液中のDOX量の時間に対する濃度の結果。平均±標準偏差（SEM）として表されるデータ（ n =3）

図8に示すように、Caelyx®とED-lipを投与されたグループの主要な収穫臓器のDOX濃度を比較しました。遊離DOXの最も重要な副作用は、Caelyx®がこの副作用のリスクを大幅に減少させる心毒性です[46]。肝臓、肺、脾臓におけるED-lipの生体内分布は、3時間の時点でCaelyx®よりも有意に高くなっています。漏れのある血管の存在と、挿入後のEDリップのサイズとPDIの増加が、これらの組織に以前にEDリップがより多く蓄積した理由である可能性があります。ナノ粒子のサイズを150nmに増やすと、肝臓、肺、脾臓でのナノ粒子の蓄積が促進されることが示されました[47]。一方、生体内分布研究の結果は、腫瘍内のナノ粒子の蓄積におけるEPRメカニズムを明確に示しています。図8は、ED-lipとCaelyx®の両方が腫瘍部位に徐々に蓄積し、約12時間で最大に達し、24時間までプラトーを維持し、48時間と72時間で徐々に減少することを明確に示しています。これは、3、12、24、48、および72時間のすべての時点で興味深いものです。腫瘍におけるED-lipの蓄積は、Caelyx®よりも大幅に多くなります。これは、抗EpCAMアプタマーによるアクティブターゲティングの有効性が原因である可能性があります。これらの結果は、リポソーム表面へのアプタマーの付着が腎臓におけるDOX分布に影響を及ぼさなかったことを示した。したがって、抗EpCAMアプタマーは、リポソームの腫瘍特異的浸透を効果的に促進するようであり、これはまた、腫瘍血管内皮細胞におけるEpCAM分子の過剰発現に起因する可能性がある[48]。以前は、抗EpCAMアプタマーが異種移植腫瘍における腫瘍浸透を増強する可能性があることが示されていました[49]。 CSCまたはTICも抗EpCAM療法の標的です。 ＥｐＣＡＭを標的化するための標的化リガンドとしての抗ＥｐＣＡＭアプタマーの投与は、ＣＳＣを標的化することにおいて有望な効果を示した［２２、５０］。ここで、ED-lipの効果的な抗腫瘍効果の一部は、CSCのターゲティングの成功によるものである可能性が示唆されます。

組織の生体内分布。心臓、腫瘍、肝臓、肺脾臓、および腎臓におけるDOX生体内分布の結果。各臓器の注射後3、12、24、48、および72時間で報告された濃度（μg/ g）。平均±標準偏差（SEM）として表されるデータ（ n =3）。 * p <0.05、** p <0.01、*** p <0.001、**** p <0.0001

InVivo抗腫瘍活動

ED-lipの治療効果はC26結腸癌腫瘍モデルで評価されました。腫瘍の大きさ、体重、生存率をほぼ2か月間モニターし、結果を図9と表4にまとめました。データは、ED-lipがCaelyx®と同様にマウスの体重に明らかな影響を与えないことを示しています（図9aを参照）。 ）。図9bに示すように、Caelyx®とED-lipの静脈内注射後、腫瘍増殖速度は注射後30日目まで効率的に抑制され、リポソーム群に有意差はありません。注射後30日後、腫瘍の成長速度は加速しましたが、薬剤投与群の成長速度は、PBS投与群よりもまだ遅かったです。 Caelyx®グループとED-lipの違いは、注射後30日間は有意ではありませんでした。生存結果は、カプランマイヤープロットで表されます。図9cは、ED-lipがPBSまたはCaelyx®と比較して生存曲線を改善することを示しています。生存研究の主な指標を表4にまとめました。ED-lipグループの3匹のマウスの腫瘍は完全に治癒したため、このグループのMSTは未定義です。 ED-lipによる治療はTTEを41。1日から49。7日に増加させ、3匹のマウスで腫瘍が完全に除去されたためMSTが未定義の90.27％TGDで効果的な抗腫瘍活性をもたらしました（表4を参照）。

C26結腸癌を有する雌のBALB / cマウスにおける製剤のinvivo治療効果。マウスは、製剤の単回投与（10mg / kg）のIV注射を受けた。 a 各実験グループにおけるBALB / cのそれぞれの重量パーセントプロファイルを表します。 b BALB / cマウスの腫瘍サイズのフォローアップを示しています。 c BALB / cの生存グラフを表示します。平均±SD（ n ）として表されるデータ =5）

腫瘍サイズのデータ​​は、ED-lipが腫瘍の成長を劇的に阻害する可能性があることを示しました。生存分析の結果は、ED-lipによる治療がMSTとTTEを増加させることを示しました。 ED-lipを投与されたグループはTGD％が高く、Caelyx®と比較してより効果的でした。我々の発見は、ED-lip治療群の腫瘍組織における高レベルのDOX濃度と一致しています。したがって、アプタマー結合リポソームDOXはそれらの浸透を改善し、その結果、腫瘍部位での薬物蓄積を増強し、それにより、Caelyx®の有効性が増加し、生存データのTGD％が高くなります。まとめると、これらの発見は、抗EpCAMアプタマーがドラッグデリバリーの重要なターゲティング剤として役立つ可能性があることを示しています。

結論

ここでは、挿入後（ED-lip）を介して抗EpCAM（SYLC3）アプタマーで表面機能化されたCaelyx®を使用しています。フローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡は、C26細胞における高レベルのDOX取り込みを示し、これは、アプタマーがED-lipの内在化プロセスの速度を高める可能性があることを示しています。薬物動態データは、DSPE-mPEG-EpCAMの挿入後は、Caelyx®と比較してDOXの薬物動態を変化させなかったことを示しました。しかし、組織の生体内分布は、注射後72時間後でも、Caelyx®と比較してED-lipの腫瘍蓄積が多いことを示しました。 ED-lipがC26腫瘍を有するマウスの治療効果を改善したことを示しました。 ED-lipで治療されたマウスの生存パラメーターの改善は、EpCAMを標的としたDOXリポソームが癌治療のための有望な薬物送達担体であることを示唆しており、さらなる調査に値します。

材料と方法

資料

5'-アミン-抗EpCAMDNAアプタマー（5'-CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-3 'の配列）（SYL3C）は、BIONEER（バイオテクノロジー企業、大田、韓国）から購入しました。 DSPE-mPEG ₂₀₀₀ -COOHはAvantiPolar Lipids（アラバマ州、アラバマ州）から購入しました。 Dowex®、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC）、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、ペニシリンストレプトマイシンおよびDAPIを含むFluoroshield™はSigma-Aldrich（セントルイス、ミズーリ州）から購入しました。市販のcaelyx®はBehestanDarou Company（テヘラン、イラン）から購入しました。

DSPE-mPEG ₂₀₀₀ の活用 アプタマーへ

Anti-EpCAMアプタマーはDSPE-mPEG ₂₀₀₀ にリンクされていました 抗EpCAMアプタマーの第一級アミン（-NH2）がDSPE-mPEG ₂₀₀₀ のカルボキシル基（-COOH）に共有結合することにより （図1）。コンジュゲーションは、EDC / NHSカップリングケミストリーを介して実行されました[51]。簡単に説明すると、DSPE-mPEG ₂₀₀₀ を２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．５）に分散させ、ＥＤＣ ／ ＮＨＳ ４００ｍＭのＥＤＣおよび１００ｍＭのＮＨＳを分散液に加えた。脂質のカルボキシル基を活性化するために、分散液を15分間撹拌した。次に、抗EpCAMアプタマーを分散液に添加し、暗所で室温で次の2時間撹拌した。脂質：抗EpCAMアプタマーのモル比は1：1であり、EDC / NHSのモル比は脂質の10倍でした。

DSPE-mPEG-Anti-EpCAMアプタマーによるCaelyx®の変更

ED-lipは挿入後の方法で合成されました。挿入後を行うために、DSPE-mPEG-anti-EpCAMアプタマーミセルを1mlのcaelyx®に60°Cで30分間添加しました。 DSPE-mPEG-EpCAMアプタマーの量は、バートレットリン酸アッセイ[52]に従って決定されました。 caelyx®のミリリットルあたりのリポソームのおおよその数に基づくと、約10 ¹⁴ 、DSPE-mPEG-anti-EpCAMの量は、各リポソームあたり10アプタマーに達するように調整されました[36]。挿入後の確認に使用されるアガロースゲル電気泳動[39]。

物理化学的特性評価

粒子サイズ、多分散度指数（PDI）、および表面電荷は、動的光散乱法（DLS）（Nano-ZS; Malvern、UK）によって決定されました。遊離のDOXを除去するために、リポソームをDowex®レジンと混合し、60分間回転させ、Poly-Prepカラム（Bio-Rad Laboratories Inc.）に通してDowex®を除去しました[53]。リポソーム製剤中のDOXの量は、LS-45蛍光分光光度計（Perkin-Elmer、UK）を使用して決定しました（励起：発光485：590 nm）。

リリース調査

DOXの放出を評価するために、1mlの製剤を9mlのデキストロース（50％ウシ胎児血清（FBS）を含む）に一定の時間間隔（0、1、2、4、6、12、および24時間）、サンプルを採取した。 Dowex®レジンで遊離DOXを除去した後、リポソームに残っている薬物の量を蛍光分光光度計で測定し、放出の割合を計算しました[39]。

細胞培養

C26結腸癌およびチャイニーズハムスター卵巣（CHO-K1）細胞株は、イランのパスツール研究所から購入しました。細胞株は、Gibco（Thermos Fisher Scientific、USA）から入手した10％のFBSと100 IU / mlペニシリン、および100 mg / mlストレプトマイシンを添加したRPMI1640培地で培養しました。細胞を37 ^° でインキュベートしました 5％CO ₂ のC と95％空気加湿雰囲気。

細胞相互作用と細胞取り込みアッセイ

製剤の細胞相互作用と細胞取り込みは、それぞれ4°Cと37°Cで評価されました。この試験では、CHO-K1とC26の2つの細胞株を選択しました。 12ウェルプレートの各ウェルに播種された細胞（2.5×10 ⁵ ウェルあたり）。 37°Cで一晩インキュベートした後、細胞とプレートに加えた処理を4°Cと37°Cに置き、さらに3時間インキュベートしました。次に、細胞をPBSで洗浄し、トリプシン処理しました。 DOXの蛍光強度は、フローサイトメトリー（BD FACSCaliburサイトメーター）を使用して決定しました。データはFlowJoバージョン7.0ソフトウェアで分析されました。

蛍光顕微鏡評価

1×10 ⁶ の数 ウェルあたりの細胞C26細胞は、滅菌顕微鏡カバーガラスがすでに挿入されている6ウェルプレートに播種されました。 37°C、湿度5％で一晩インキュベートした後、細胞を遊離のDOX、Caelyx®、ED-lipで24時間処理し、細胞を完全に取り込みました[54]。次に、細胞をPBSで洗浄し、4％ホルムアルデヒドで固定しました。 DAPIを使用してFluoroshield™で染色されたカバーガラスをスライドガラスにマウントしました。治療は3回行った。各スライドから、200倍の倍率フィールドの下で6つのゾーンが選択されました。薬物細胞の取り込みの評価には、DOXの固有蛍光を使用しました。スケーリングは、各顕微鏡フィールドでDOX細胞の取り込みを示した細胞のパーセンテージに基づいて実行されました：

1：0〜20％、2：20〜40％、3：40〜60％、4：60〜80％、5：80〜100％

細胞毒性の評価

遊離DOX、caelyx®、およびED-lipのIC50値は、MTTアッセイによって決定されました。これを行うために、CHO-K1およびC26細胞を5×10 ³ の密度で播種しました。 37°Cの96ウェルプレートのウェルあたりの細胞数。一晩のインキュベーション後、リポソーム製剤および遊離のDOX溶液をFBSを含まない培地で段階希釈し、細胞培養物に添加し、37℃で1、3、および6時間インキュベートした。次に、細胞を洗浄し、72時間インキュベートしました。光学密度（OD）は、Stat-Fax 2100マイクロプレートリーダー（Awareness Technology Inc. USA）で630nmのバックグラウンドに対して570nmの分光吸光度を使用して測定しました。次に、IC50値が計算されました。

動物実験

雌のBALB / cマウス（4〜6週間、18〜20 g）を、22±2°Cの別々のケージに入れ、標準的なペレット食と水を自由に摂取させて飼育しました。動物を麻酔するために使用されるケタミンおよびキシラジン（100mg / kgケタミンおよび10mg / kgキシラジン）の腹腔内（i.p）注射[55]。 3×10 ⁵ の数 右脇腹に皮下注射した60μlのPBS中のマウスあたりC26細胞。接種から2週間後、腫瘍のサイズが約5 mm ³ 、マウスをランダムに3つのグループに分けました（ n =生体内分布および n の場合は3 =グループあたりの抗腫瘍研究マウスの場合は5）。すべての実験プロトコルは、マシュハド医科大学の動物倫理委員会によって承認され、動物の権利を考慮した国際規則に従って実施されました。

生体内分布と薬物動態研究

腫瘍接種の14日後、マウスを10mg / kgのcaelyx®およびED-lipの用量で尾の無駄を介して静脈内（i.v.）で治療した。対照群は200μlのPBS溶液を受け取った。特定の時間間隔（3、12、24、48、および72時間）で、注射後のマウスを安楽死させ、血液サンプルおよび組織サンプル（肝臓、脾臓、腎臓、肺、心臓、および腫瘍）を収集した。次に、LS-45蛍光分光光度計（Perkin-Elmer、UK）を使用して、各サンプルの蛍光強度に基づいて測定された各サンプル中のドキソルビシンの濃度。各サンプルのドキソルビシン濃度を測定し、薬物動態パラメータの非コンパートメント分析を血中濃度対時間プロファイルから計算しました。次に、濃度-時間曲線（AUC）および一次モーメント曲線（AUMC）の下の面積、半減期（ t ）を含むパラメーター _1/2 ）、分布容積（ V _d ）、 C _max 、 T _{max 、、} 平均滞留時間（MRT）とクリアランス（Cl）が計算されました。

InVivo抗腫瘍活性

抗腫瘍活性を評価するために、腫瘍接種の10日後に、触知可能な腫瘍サイズを有するマウスに単回静脈内投与した。 10mg / kgのCaelyx®およびED-lipの用量。ネガティブコントロールと見なされるマウスに注射されたPBS。エンドポイントに到達するまでの時間（TTE）、腫瘍増殖遅延のパーセンテージ（TGD）、生存期間の中央値（MST）、および生存を含むパラメーターが決定されました。研究中、マウスの健康と体重の変化を観察しました。腫瘍体積もデジタルノギスを使用して測定され、次のように計算されました。

倫理的側面を考慮して、腫瘍の成長が1000 mm ³ を超えた場合は、マウスを除外しました。 、または> 20％の体重減少または脱力感の兆候が観察されました。

統計分析

GraphPad Prism 6.0（GraphPad software、Inc.、San Diego、CA、USA）を使用してデータを分析しました。データは、少なくとも3回の独立した実験の平均±SEMとして示されました。 t 試験は、放出研究、フローサイトメトリー、および製剤の生体内分布の結果を評価するために使用されました。 ANOVAを使用して、蛍光マイクロコピーと腫瘍体積の結果を評価しました。生存パラメータの計算に使用されるカプランマイヤー法には、TTE、MST、およびTGD％が含まれます。 P <0.05は統計的に有意であると見なされました。

データと資料の可用性

この記事の結論を裏付けるすべてのデータが記事に含まれています。

略語

EpCAM：

上皮細胞接着分子

NDDS：

ナノドラッグデリバリーシステム

DOX：

ドキソルビシン

EPR：

強化された透過性と保持力

ECM：

細胞外マトリックス

CSC：

がん幹細胞

TIC：

腫瘍開始細胞

MFI：

平均蛍光強度

MPS：

単核食細胞系

EDC：

1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド

NHS：

N-ヒドロキシスクシンイミド

PDI：

多分散度指数

DLS：

動的光散乱装置

FBS：

ウシ胎児血清

OD：

光学密度

AUC：

濃度-時間曲線下の面積

AUMC：

一次モーメント曲線の下の面積

t _½ ：

半減期

V _d ：

分布容積

MRT：

平均滞留時間

Cl：

クリアランス

TTE：

エンドポイントに到達する時間

TGD：

腫瘍増殖遅延の割合

MST：

生存期間の中央値

i.p。：

腹腔内

i.v。：

静脈内