トリプルネガティブ乳がんの治療を強化するための第一鉄イオン供給のためのアルテミシニンの担体としてのFe（II）およびタンニン酸クロークMOF

はじめに

新たに発見された細胞死のサブタイプであるフェロトーシスは、鉄依存性脂質ヒドロペルオキシド（LPO）の蓄積を引き起こし、細胞構造と完全性の損傷につながる可能性があります[1,2,3]。新たな証拠は、いくつかの小分子によるフェロトーシスの活性化がさまざまな実験的癌モデルにおける腫瘍抑制の効果的なアプローチであり、新しい抗癌療法としてのフェロトーシスの可能性に大きな期待を生み出したことを示唆しています[4,5,6]。トリプルネガティブ乳がん（TNBC）は、乳がんの最も攻撃的なサブタイプであり、標的療法を欠いており、腫瘍の再発、遠隔転移、および治療への抵抗性に関連していることがよくあります[7]。以前の研究では、xCTシスチン/グルタミン酸アンチポーターは多くのTNBC細胞で高度に発現しており、グルタチオン（GSH）レベルと酸化還元バランスの維持に重要な役割を果たしていることが指摘されています[8]。細胞内GSH含有量の減少は、TNBC細胞をフェロトーシスに感受性にし、それによって腫瘍細胞を殺す可能性があります[8]。特に、フェロトーシスは、ルーチンのプログラム細胞アポトーシスに対するTNBCの耐性を回避することもできます[9]。したがって、フェロトーシスの誘発に基づく戦略または薬剤は、難治性TNBCの臨床治療に治療の可能性を秘めている可能性があります。

過酸化物基を含むセスキテルペンラクトンであるアルテミシニン（ART）は、繁体字中国語の植物 Artemisia annua から分離されました。 また、複数の癌細胞株で望ましい抗腫瘍活性を示しています[10、11]。増加する証拠は、癌細胞が正常細胞よりも有意に多くの細胞内鉄プールを含む一方で、エンドペルオキシドブリッジの鉄媒介切断により、ARTが複数の癌細胞株で細胞死を選択的に引き起こすことを可能にすることを示しました[12、13]。鉄イオンに依存する抗腫瘍活性は、ARTによって調節されるフェロトーシスにますます注目を集めています[13]。機械論的に、ARTはオートファジーに依存しない方法でフェリチンのリソソーム分解を誘発し、第一鉄イオンの細胞レベルを増加させ、細胞をフェロトーシスに感作させることができます[11]。

ただし、ARTがTNBCでフェロトーシスを誘発するかどうかは不明なままです。さらに、水溶性の低さや細胞内鉄イオンの利用可能性の不足などの一連の要因により、抗腫瘍療法におけるARTのさらなる適用が制限されています[13]。 ARTナノ複合体は、ARTベースの抗腫瘍薬の将来のナノドラッグデリバリーシステムとして成功裏に使用されることが期待されています[14、15、16]。近年、多孔質高分子材料の一種である金属有機フレームワーク（MOF）が、その大きな細孔サイズ、高い見かけの表面積、および小分子の選択的取り込みの実証により注目を集めています[17、18、19]。 MOFタイプの材料の代表として、ゼオライトイミダゾレートフレームワーク（ZIF-8）は、pH応答性、高い薬物負荷、および優れた生体適合性の特性を備えたナノ医薬品の開発に広く使用されています[20、21、22、23 ]。さらに、MOFに調整可能な表面を組み込む機能により、表面特性とその多機能性の付与を制御できます[24、25]。 MOF表面での金属-フェノール配位コートの超分子集合体は、刺激応答性分解、コロイド安定性、生体適合性などの望ましい特性により、最近注目を集めています[26、27]。 MOFの金属-フェノール配位材料は、疎水性ARTを提供するための理想的な媒体となる可能性があります。

これに触発されて、TNBC細胞のフェロトーシスを調節するためのART（TA-Fe / ART @ ZIF）をカプセル化した第一鉄イオン-タンニン酸配位被覆ZIF-8ナノシステムを開発しました。これを図1に示します。優れた生体適合性とpH応答性の放出により、ARTをカプセル化するナノキャリアとして選択されました。第一鉄イオン-TA配位コートは、分散安定性と第一鉄イオン（Fe（II））の供給を目的として、ART @ZIFの表面に固定化されました。細胞内で調製されたままのナノシステムの内部移行に続いて、ビヒクルの酸性分解は、ARTの放出およびFe（II）の蓄積を促進するであろう。細胞内のFe（II）レベルのアップレギュレーションは、鉄を介したエンドペルオキシドブリッジの切断を通じてARTをラジカルに分解し、フェロトーシスの効果を著しく高めます。結論として、TA-Fe / ART @ ZIFを介したフェロトーシスの発見は、TNBCに対する新しい治療法の開発に新しい展望を提供する可能性があります。

TA-Fe / ART @ZIFナノ粒子の調製と腫瘍細胞におけるアポトーシス/フェロトーシスの相乗的誘導の概略図

材料と方法

試薬

アルテミシニン（99％）、2-メチルイミダゾール（98％）、硝酸亜鉛（ZnNO ₃ ; 98％）、Ta（98％）、硫酸第一鉄（FeSO ₄ ; 98％）、および無水メタノールはAladdin-Reagent Co. Ltd.（Shanghai、China）から提供されました。

TA-Fe / ART @ZIFナノ粒子の製造

ART @ ZIFナノ粒子を調製するために、200mgのARTを1mLの無水メタノールに溶解し、2 gの2-メチルイミダゾール（溶媒は8 mLの無水メタノール）を得られたART溶液にゆっくりと加えました。マグネチックスターラーで、0.2 gの硝酸亜鉛（溶媒は1 mLの無水メタノール）をゆっくりと加えました。最後に、溶液の量を15 mLに調整し、10分間撹拌して、薄白色の溶液を得ました。 10,000 rpmで遠心分離した後、サンプルをメタノールで3回洗浄しました。上澄みはARTの含有量を測定するためのものであり、沈殿剤は凍結乾燥してさらに使用するための固体状態を得ました。

TA-Fe / ART @ ZIFナノ粒子を調製するために、TA溶液（脱イオン水中40 mg / mL、2 mL）をART @ ZIF溶液（10 mg / mL、4 mL）にゆっくりと加えました。 20分間攪拌した後、5 mg / mLのFeSO ₄ 上記の溶液にゆっくりと加えた。 30分間繰り返し攪拌した後、濃紫色の溶液が得られました。最後に、10,000rpmでの遠心分離によって沈殿物を収集しました。沈殿物を脱イオン水で3回洗浄し、凍結乾燥して、さらに使用するためのTA-Fe / ART @ZIFを得ました。

特性評価

TEM（JEM-1230; JEOL、東京、日本）を使用して、ナノ粒子の各部分の形態学的および元素組成を決定しました。動的光散乱とゼータ電位（DLS; ZetasizerNanoシステムMalvernInstruments、Malvern、UK）を使用して、ナノ粒子の粒子サイズと電気的安定性を評価しました。フーリエ変換赤外分光法（VERTEX 70; Bruker、Bremen、Germany）と熱重量分析を使用して、ナノ粒子の成分の組成を分析しました。 X線光電子分光法（XPS）の測定は、PHI 5000 Versa Probe III（Physical Electronics）を使用して行われました。 TA-Fe / ART @ ZIF材料の元素組成は、EDX（Carl Zeissモデル：Neon-40）を使用して実行されました。

カプセル化効率と負荷容量の測定

高速液体クロマトグラフィー（HPLC）（Agilent 1200; Agilent Technologies、Santa Clara、CA）を使用して、上清中のARTの量を測定しました。 ARTの薬物負荷率とカプセル化率は、次のように計算できます。

TA-Fe / ART @ZIFナノ粒子のinvitro放出とpH応答

2 mgのナノ粒子で包まれた処理済みの透析膜を、それぞれpH 7.4および5.0のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）50 mLに入れ、37°C​​で連続的に振とうしました。透析膜の外側の溶液は、実験開始後15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、8時間、および10時間にサンプリングされました。緩衝液中のARTの含有量は、HPLCを使用して測定しました。

細胞培養

MDA-MB-231およびL929細胞株は、American Type Culture Collection（American Type Culture Collection、マナッサス、バージニア州、米国）から入手しました。細胞は37°C、5％CO ₂ で培養されました 10％ウシ胎児血清（Cyclone、ユタ州、米国）、100 µg / mLのピルビン酸ナトリウム、ペニシリン、およびストレプトマイシン（Solarbio北京、中国）を添加したRPMI-1640培地（Solarbio、北京、中国）の湿度。

インビトロでの細胞毒性試験

細胞生存率は、文献の手順[28、29]に従って、3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）アッセイを使用して決定しました。

MDA-MB-231細胞とL929細胞は、96ウェルプレートの標準細胞培地（ウェルあたり5,000細胞）で培養し、5％CO ₂ で培養しました。 37°Cで24時間。ウェル内の液体を廃棄し、PBSとさまざまな濃度のART、TA-Fe / ZIF、TA-Fe / ART @ ZIF、デフェロキサミン（DFO、MedChemExpress、上海、中国）を含む無血清培地のウェルあたり100μL ）、N-ベンジルオキシカルボニル-Val-Ala-Asp（O-Me）フルオロメチルケトン（Z-VAD-FMK、MedChemExpress、上海、中国）、およびフェロスタチン-1（Fer1、MedChemExpress、上海、中国）が96に追加されました-ウェルプレート。 48時間後、10μLのMTT（5 mg / mL）を追加し、さらに4時間インキュベートしました。最後に、自動酵素マーカー（BioTek Instruments Inc.、USA）を使用して、各ウェルの吸光度を測定しました。結果は、細胞生存率のパーセンテージとして表されました。

カルセイン-アセトキシメチル（カルセイン-AM）染色アッセイ

MDA-MB-231細胞を24ウェルプレート（2×10 ⁴ ）で培養しました ウェルあたりの細胞数）、24時間インキュベートします。続いて、細胞をさまざまな濃度のTA-Fe / ART @ZIFナノ粒子で24時間処理しました。培地を廃棄した後、細胞をカルセイン-AM（Beyotime Biotechnology、上海、中国）で暗所、4°Cで20分間染色し、蛍光倒立顕微鏡（オリンパス、東京、日本）で観察しました。

アポトーシスのフローサイトメトリー

MDA-MB-231細胞を2.5×10 ⁵ の密度で6ウェルプレートに配置しました。 同じ条件下でウェルあたりの細胞数。 PBSで処理した後、ART、TA-Fe / ZIF、およびTA-Fe / ART @ZIFを24時間適用しました。続いて、細胞を遠心分離し、6ウェルプレートから収集した。ヨウ化プロピジウムとアネキシンV二重染色（アネキシンV-FITCキット、ベックマンコールター、マルセイユ、フランス）の後、フローサイトメトリーを使用して検出しました。

Invitro活性酸素種（ROS）測定アッセイ

細胞内のROS含有量は、ROS蛍光プローブ（ジクロロ-ジヒドロ-フルオレセインジアセテート（DCFH-DA、Beyotime Biotechnology、上海、中国）を使用して実行されました。MDA-MB-231細胞は6ウェルプレート（2.5×10 ⁵ ウェルあたりの細胞数）および5％CO ₂ でインキュベート 37°Cで24時間。ウェルからの液体を廃棄し、細胞を次のように処理した：ブランク対照群（無血清培地）、陽性対照群、および実験群（異なる濃度のナノ粒子）。 37°Cで8時間インキュベートした後、0.1％DCFH-DAを各ウェルに添加し、細胞を30分間インキュベートしました。 DCFH-DAに反応しない細胞をPBSで除去し、蛍光倒立顕微鏡（オリンパス、東京、日本）で観察しました。

マロンジアルデヒド（MDA）とGSH含有量の決定

MDAアッセイキット（TBA法; Jiancheng Bioengineering、南京、中国）およびGSHアッセイキット（Beyotime Biotechnology、上海、中国）を使用して、MDAおよびGSHの細胞内レベルを測定しました。 PBS、ART、TA-Fe / ZIF、およびTA-Fe / ART @ ZIFで処理した後、MDA-MB-231細胞を収集してカウントしました。 MDAとGSHの細胞内含有量は、キットに含まれている指示に従って決定されました。

ウエスタンブロット分析

異なるナノ粒子で処理されたMDA-MB-231細胞は、RIPA溶解バッファーで溶解されました。タンパク質濃度を測定した後、10％SDS-PAGEゲルを使用してさまざまなサンプルのタンパク質を分離し、ニトロセルロースメンブレンに転写しました。サンプルタンパク質をロードしたニトロセルロースメンブレンを0.5％BSAタンパク質溶液で1時間ブロックし、ニトロセルロースメンブレンと一次抗体を4°Cで24時間インキュベートしました。ニトロセルロースメンブレンから一次抗体をTBSTでリンスし、対応する二次抗体と常温で2時間置き続けました。セルロース膜上の二次抗体を洗い流した後、ニトロセルロース膜を化学発光溶液として使用し、ゲルイメージングシステムで観察しました。

InVivo抗腫瘍実験

すべての動物実験は濰坊医学大学の倫理委員会によって承認されました。健康な雌のヌードマウス（年齢：4週、体重：13〜17 g、バイタルリバー、北京、中国）に5×10 ⁶ を投与しました。 150 µlのリン酸緩衝生理食塩水中のMDA-MB-231細胞。腫瘍の体積が70〜120 mm ³ に増加したとき 、マウスはランダムに4つのグループに分けられました。マウスの各グループは、PBS、ART（20 mg / kg）、TA-Fe / ZIF（80 mg / kg）、およびTA-Fe / ART @ ZIF（100 mg / kg）で個別に処理されました。各マウスは、3日ごとに腹腔内注射によって治療された。 14日後、すべてのマウスが殺されました。腫瘍組織と重要な臓器は、ヘマトキシリンおよびエオシン染色のために収集されました。

統計分析

すべての実験は少なくとも3回繰り返された。すべてのデータは、SPSSバージョン22.0ソフトウェア（IBM Corp.、米国アーモンク）を使用して統計的に分析されました。結果は、平均±標準偏差として表されました。 P 値<0.05は統計的有意性を示します。

結果と考察

TA-Fe / ART @ZIFナノ粒子の特性評価

最初に、ART @ ZIFナノ粒子は、文献の手順[30]に従って、メタノール、酢酸亜鉛、2-メチルイミダゾール、およびARTから室温で合成されました。次に、TAと第一鉄イオンをボルテックスすることにより、ART @ZIFテンプレートの周囲に安定した金属-ポリフェノール超分子膜が急速に形成されました。報告されている磁性ナノ粒子[31,32,33]と比較して、TA-Fe / ART @ ZIFは、過酷な化学的または熱水反応を伴わずに、MOFの表面にTA-Fe膜をフォーマットする自己組織化法によって調製されました。さらに重要なことに、TA-Fe / ART @ ZIFナノキャリアは、低pHによってトリガーされ、ARTとFe（II）を放出します。これは、ARTのエンドペルオキシドによってさらに触媒され、C中心のフリーラジカルを生成し、フェロトーシスを著しく増強します。 。最初の遠心分離からの上清を使用してHPLCで測定したカプセル化効率は66.7％でした。上澄みはTA-Fe / ART @ ZIFナノ粒子によって得られ、ARTの計算された薬物負荷は11.4％でした。 FTIR分光法（図2a）によると、ARTの特徴的な吸収ピーク、つまり1,738 cm ^-1 のカルボニル結合 724 cm ^-1 のペルオキシブリッジ [34]は、TA-Fe / ART @ ZIFナノ粒子で観察され、ARTがナノ粒子にうまくカプセル化されたことを示しています。次に、熱重量分析の結果、温度が約400°Cに上昇するとARTが完全に廃止されたことが明らかになりました（図2b）。 TA-Fe / ZIFナノ粒子と比較すると、ARTはTA-Fe / ART @ ZIFナノ粒子の総重量の7.1％を占めており、これは基本的にHPLC分析の結果と一致しています。

a ART、ZIF-8、およびTA-Fe / ART @ZIFのFTIR; b ART、TA-Fe / ZIF、およびTA-Fe / ART @ ZIFの熱重量分析（TGA）

TEMの結果は、ZIF-8とART @ ZIFが同様の均一な六角形の構成を示し、粒子サイズ分布が約100 nmで決定されたことを示しています（図3a、b）。 TA-Fe / ART @ ZIFナノ粒子は球状の構成を示し、粒度分布は150nmでした。完全なART @ ZIFと比較して、Fe（II）およびTAでコーティングされたTA-Fe / ART @ ZIFは、明らかな従来のコアシェル構造を示し、TA-Fe膜のサイズは約30 nmでした（図3a）。さらに、形成されたナノ粒子の面積-元素マッピング分析を実行しました。面積-元素マッピングにより、TA-Fe / ART @ ZIFナノ粒子の周辺がFe元素で囲まれていることが確認され、Fe（II）とTAが正常にクローキングされたことを示しています（図3b）。 XPS測定は、TA-Fe / ART @ZIF複合材料の表面元素組成と相互作用を調査するために行われました。 TA-Fe / ART @ ZIFのワイドスキャンXPSスペクトルは、追加ファイル1：図1に示されています。 285、408、531、737、および1036 eV付近に現れる主要なピークは、それぞれC 1s、N 1s、O 1s、Fe 2p、およびZn 2pに関連しており、TA-Fe / ART @ZIFナノコンポジットの形成を示しています。 。さらに、TA-Fe / ART @ ZIFのEDSマッピング画像は、追加ファイル1：図2に示されています。炭素（C）、窒素（N）、酸素（O）、鉄（Fe）、亜鉛（Zn）などの元素に対応するピークがXPSスペクトルとよく一致していることがはっきりとわかります。 Fe（II）の量を増やすことにより、TA-Fe / ART @ ZIFナノ粒子の流体力学的直径が増加することがわかりました（追加ファイル1：図3s）。コーティングをさらに確認するために、さまざまなナノ粒子のゼータ電位を測定しました。 ART @ ZIF粒子上のTA–Fe（II）層の形成により、TAの酸性の性質により、表面ゼータが+ 21mV電位から-19.5mVにシフトしました（追加ファイル1：図4s）。以前の文献で報告されているように[30]、TA構造の豊富なポリフェノール基は、基板コーティング能力を付与するだけでなく、遷移金属イオン（Fe、Zn）と配位して金属-フェノール複合体を形成することもできます。 Zn ²⁺ の場合 とHmimを混合して、Zn ²⁺ の塊である溶液を形成します。 イオンはART @ ZIF粒子の表面で配位します。したがって、ART @ZIFのゼータ電位は+ 21mVです。 TAのフェノール基（pKa 8.5）は負に脱プロトン化されたため、正に帯電したZn ²⁺ と相互作用する可能性があります。 、ART @ ZIF表面でのTA–Fe膜の成長を促進します。ドラッグデリバリーは保因者に有利であるため、安定性はそれらの薬用用途にとって重要な要素です。ナノ粒子の安定性は、PBSに1週間分散させることで実証されました。追加ファイル1：図5sに示されているように、粒子サイズは、研究の時間経過から望ましいサイズと安定性を示しました。

a ZIF-8、ART @ ZIF、およびTA-Fe / ART @ZIFナノ粒子のTEM画像とサイズ分布。スケールバー：100 nm; b TA-Fe / ART @ZIFナノ粒子中の炭素および鉄元素の分布。スケールバー：100 nm

a pH7.4および5.0でのTA-Fe / ART @ZIFナノ粒子からのARTのinvitro放出。 b 0、12.5、25、50、および100μg/ mLでのMDA-MB-231細胞におけるART、TA-Fe / ZIF、およびTA-Fe / ART @ZIFナノ粒子の細胞毒性。 c さまざまな濃度のTA-Fe / ART @ZIFで処理されたL929細胞の生存率。 d 0、25、50、および100μg/ mLの濃度のTA-Fe / ART @ZIFナノ粒子で処理されたMDA-MB-231細胞のカルセイン-AM染色

ART、TA-Fe / ZIF、およびTA-Fe / ART @ZIFナノ粒子で処理されたMDA-MB-231細胞におけるDCFH-DAの蛍光によって検出されたROS生成

invitroでのTA-Fe / ART @ZIFの放出と細胞毒性

次に、TA-Fe / ART @ ZIFがpH応答性の分解挙動を示すかどうかを調べるために、中性および酸性条件下でのナノ粒子からのARTの放出を調べました。図4aに示すように、酸性条件では、ナノ粒子は1時間以内にARTの約58％を急速に放出できます。ただし、中性条件下では、ナノ粒子は微量のARTしかゆっくりと放出できません。さらに、透析膜の外部溶液を水酸化ナトリウムで処理している間、pH =5.0基の溶液を水酸化ナトリウムと反応させて、かなりの白色の沈殿物を生成した。ただし、この現象はpH =7.4グループでは観察されませんでした。

私たちの仮説によれば、白い沈殿物は、酸性条件下でナノ粒子から亜鉛イオンとアルカリが解離することによって形成される水酸化亜鉛沈殿物です。まとめると、この証拠は、私たちのナノ粒子が酸性条件下で解離する能力を持っていることをうまく示しています。

TA-Fe / ART @ ZIFナノシステムの設計では、TA-Fe（II）およびZIF構造が切除され、腫瘍微小環境の酸性条件下で、包まれたARTおよびFe（II）が放出されます。細胞内のFe（II）レベルのアップレギュレーションは、鉄を介したエンドペルオキシドブリッジの切断を通じてARTをラジカルに分解し、フェロトーシスの効果を著しく高めます。したがって、MDA-MB-231細胞およびL929細胞に対するナノシステムの細胞毒性を研究するためにMTTアッセイを実施しました。 ARTと比較して、TA-Fe / ART @ ZIFナノ粒子は、MDA-MB-231細胞に対してより高い細胞毒性を示し（図4b）、正常細胞に対しては低い細胞毒性を示しました（図4c）。 TA-Fe / ART @ ZIFナノ粒子はMDA-MB-231細胞の活性を53.9％阻害しましたが、同じ濃度のARTは全細胞の24.1％しか阻害しませんでした。カルセイン-AM染色の実験結果により、TA-Fe / ART @ ZIFナノ粒子の濃度が高くなるにつれて、生存可能なMDA-MB-231細胞の量が徐々に減少することが確認されました（図4d）。

TA-Fe / ART @ ZIFMDA-MB-231セルでの強化されたROS生成

ARTは、エンドペルオキシドブリッジの鉄を介した切断によって生成されるROSの生成を介してその抗癌活性を発揮することが知られています[35、36]。したがって、2 '、7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（DCHF-DA）プローブによるROS生成を誘導するTA-Fe / ART @ZIFの効率を調べました[37]。図5に示すように、ARTおよびTA-Fe / ZIFで処理した細胞では、未処理のグループと比較してわずかに強い蛍光シグナルが観察されました。これは、ARTおよびFe（II）イオンがROS生成を誘発する可能性があることを示しています。対照的に、TA-Fe / ART @ ZIFナノ薬物への強い蛍光シグナル曝露は、ARTのFe（II）を介したエンドペルオキシドの切断によって生成される望ましいROS収量の証拠として細胞内に見られます。細胞内で調製されたままのナノシステムは分解され、Fe（II）の蓄積を引き起こし、ROS生成を著しく強化します。 ARTとその誘導体の抗がん効果は、DNA損傷応答、リソソームを介した異化プロセスのマクロオートファジー、酸化ストレスなど、さまざまな細胞プロセスによってアポトーシスを誘導する能力に起因しています[13、35、38]。また、ARTにおけるエンドペルオキシドブリッジの鉄を介した切断が、多くの種類の癌細胞のフェロトーシスに対する細胞内の酸化バランスに影響を与える可能性があることも報告されています[11]。酸化的不均衡に基づくフェロトーシスのこの誘導は、Fe（II）の添加によりさらに増幅することができます。 Fe（II）はARTを活性化しますが、細胞内過酸化水素と反応してフェントン反応によりヒドロキシルフリーラジカルを生成し、腫瘍細胞におけるARTのアポトーシス誘導効果を高めます。

TA-Fe / ART @ZIFがMDA-MB-231細胞でアポトーシスとフェロトーシスを誘発

一方、細胞死とFe（II）の役割を調査するために、鉄キレート剤デフェロキサミン、アポトーシス阻害剤Z-VAD-FMK、およびフェロトーシス阻害剤フェロスタチン-1を利用してこれらの細胞を救出しました。予測されたように、Fe（II）のスカベンジャーであるデフェロキサミンは明らかに細胞死をブロックする可能性があり、Fe（II）の重要な役割を示唆しています。さらに、MDA-MB-231細胞の生存率は、アポトーシスとフェロトーシス阻害剤によってそれぞれ31.4％から56.3％と76.0％に大幅に改善され（図6a）、TA-Fe / ARTにおけるアポトーシスとフェロトーシスの重要性が強調されています。 @ZIFナノ粒子は細胞死を仲介しました。さらに、アポトーシスの程度を定量的に決定するために、フローサイトメトリーによるアネキシンV-FITCベースのアッセイを採用しました。結果は、TA-Fe / ART @ ZIFナノ粒子がMDA-MB-231細胞の21.8％でアポトーシスを誘発する可能性があることを示しています（追加ファイル1：図6s）。このパーセンテージはARTで記録されたパーセンテージよりも高く、アポトーシスがTA-Fe / ART @ ZIFナノ粒子を介して関与していることを意味しますが、それが主な原因ではありません。

a 阻害剤であるDFO（デフェロキサミン）、Fer-1（フェロスタチン-1）、およびZ-VAD-FMKは、それぞれ100μg/ mLのTA-Fe / ART @ZIFナノ粒子で処理されたMDA-MB-231細胞の生存率を救済しました。 b ART、TA-Fe / ZIF、およびTA-Fe / ART @ ZIFナノ粒子は、MDA-MB-231細胞の過剰なMDAに寄与しました。 c ART、TA-Fe / ZIF、およびTA-Fe / ART @ ZIFナノ粒子は、細胞内GSHを消費しました。 d ART、TA-Fe / ZIF、およびTA-Fe / ART @ZIFナノ粒子で処理されたMDA-MB-231細胞におけるGPX4タンパク質の発現レベル

フェロトーシスの一般的な特徴は、内因性脂質過酸化です[39]。脂質過酸化の産物であるMDA [40]は、フェロトーシスの程度を評価するために調査されました。結果は、TA-Fe / ART @ ZIFナノ粒子のMDAレベルが対照群の約2.5倍であることを示しました（図6b）。これは、ナノキャリアが豊富なFe（II）の存在と、それに対応する脂質ラジカルレベルの上昇が原因であると推定されました。細胞内の主要な抗酸化成分の1つとして、細胞内GSHはフェロトーシスを伴って減少します[41]。フェロトーシスにおけるGSHの重要な役割を考慮して、TA-Fe / ART @ZIFナノ粒子で処理した後の細胞内GSHレベルを評価しました。 GSHは、ビヒクルで処理した細胞と比較して大幅に減少しました（図6c）。これは、TA-Fe / ART @ ZIFナノ粒子によるARTのFe（II）を介した活性化に集中したGSHの枯渇と酸化の不均衡の強力な証拠を提供しました。次に、GPX4活性に対するTA-Fe / ART @ZIFナノ粒子の影響を理解するためにウエスタンブロッティングを実施しました[42]。 TA-Fe / ART @ ZIFナノ粒子は、ARTよりもGPX4活性の阻害をより顕著に引き起こすことが観察されました（図6d）。これらのデータは、GSHの枯渇の最大の程度ともよく一致しました。

InVivo抗腫瘍実験

腫瘍を有するヌードマウスにおける皮下異種移植腫瘍の阻害により、インビボでのMDA-MB-231細胞に対するナノ粒子の抗腫瘍効果を評価した。 14日間の治療中、他のグループと比較して、TA-Fe / ART @ ZIFナノ粒子は、Fe（II）-ART反応による豊富なROS生成の結果として、MDA-MB-231異種移植腫瘍の増殖を大幅に抑制することができます（図。7a）。さらに、すべての実験グループで体重に有意な多様性はなく（図7b）、TA-Fe / ART @ZIFの副作用はごくわずかであることがわかりました。治療効果をさらに研究するために、腫瘍およびその他の正常組織を、14日間治療した後にH＆E染色で調べました。図8に示すように、TA-Fe / ART @ ZIFは腫瘍組織で最大の細胞死領域を引き起こしましたが、正常組織では明らかな損傷やアポトーシスはありませんでした。全体として、これらの結果は、TA-Fe / ART @ ZIFを介した治療が抗がん効果をもたらすだけでなく、SFT-MBを介した治療では急性の全身毒性のレベルが低いことを示しています。

a PBS、ART、TA-Fe / ZIF、およびTA-Fe / ART @ZIFナノ粒子で処理した後の相対的な腫瘍体積。 b さまざまなグループの相対的なマウスの体重

さまざまなマウスグループの臓器および腫瘍のH＆E染色。スケールバー：50μm

結論

要約すると、フェロトーシスは、現在普及している治療法の避けられない障壁を克服するための排他的な利点があるため、TNBC治療の潜在的な治療法を提供します。ここでは、強化されたフェロトーシスのための配位駆動自己組織化によってカプセル化されたARTでZIFナノ粒子にコーティングされたTA–Fe（II）に基づくART用の第一鉄供給ナノキャリアを設計しました。ナノキャリアは弱酸性微小環境に溶解してARTとFe（II）を放出し、さらに高レベルの細胞内ROSとMDAを引き起こし、GSHとGPX4の減少を伴い、強力な腫瘍増殖阻害と抗癌をもたらしますinvitroおよびinvivoでの有効性。この作品は、強誘電性ナノメディシンの効力とTBNC療法の新しい方向性を強化するための新しいアプローチを提供します。 TA-Fe / ART @ ZIFによって誘発されるフェロトーシスの生体適合性と包括的なメカニズムは、さらなる調査のために確保する必要があります。

データと資料の可用性

すべてのデータは制限なしで完全に利用可能です。

略語

MOF：

金属有機フレームワーク

TNBC：

トリプルネガティブ乳がん

ART：

アルテミシニン

TA：

タンニン酸

ZIF：

ゼオライトイミダゾレートフレームワーク-8

TA-Fe / ART @ ZIF：

タンニン酸と第一鉄イオンがゼオライト系イミダゾレートフレームワーク-8にコーティングされ、アルテミシニンがカプセル化されています

ROS：

活性酸素種

LPO：

脂質ヒドロペルオキシド

GSH：

グルタチオン

TEM：

透過型電子顕微鏡

FTIR：

フーリエ変換赤外分光法

HPLC：

高速液体クロマトグラフィー

PBS：

リン酸緩衝生理食塩水

MTT：

3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド

DFO：

デフェロキサミン

Fer-1：

フェロスタチン-1

Z-VAD-FMK：

N-ベンジルオキシカルボニル-Val-Ala-Asp（O-Me）フルオロメチルケトン

カルセイン-AM：

カルセイン-アセトキシメチル

DCFH-DA：

ジクロロ-ジヒドロ-フルオレセインジアセテート

MDA：

マロンジアルデヒド

BSA：

ウシ血清アルブミン

TBST：

トリス緩衝生理食塩水トゥイーン

SDS-PAGE：

ポリアクリルアミドゲル電気泳動

GPX4：

グルタチオンペルオキシダーゼ4