抗菌剤としてRumexhymenosepalusを使用して合成されたAu @ Ag Core @Shellナノ粒子

要約

この作業では、core @ shell構造（Au @ AgNPs）を持つ金-銀バイメタルナノ粒子の順次合成法を使用しました。 Rumex hymenosepalus カテキンとスチルベンに高い含有量を示す根抽出物（Rh）は、ナノ粒子合成の還元剤として使用されました。透過型電子顕微鏡（TEM）によって得られたサイズ分布は、Au @ AgNPの平均直径が36±11nm、金ナノ粒子（AuNP）の平均直径が24±4 nm、銀ナノ粒子（AgNP）の平均直径が13±3nmです。 NPの幾何学的形状は主に準球形でした。 AuNP上の銀の殻の厚さは約6nmで、表面は活性生体分子で覆われています。ナノ粒子の特性評価には、走査透過電子顕微鏡（STEM）、エネルギー分散型X線分光法（EDS）、X線回折（XRD）、UV-Vis分光法、ゼータ電位で記録された高角度環状暗視野像（HAADF）が含まれます。および動的光散乱（DLS）。フーリエ変換赤外分光計（FTIR）およびX線光電子分光法（XPS）は、ナノ粒子が抽出分子によって安定化されていることを示しています。ナノマテリアルに曝露された微生物のゴンペルツモデルを使用して、成長速度論の研究が行われました。結果は、AgNPとAu @AgNPが Escherichiacoli の遅滞期と増殖速度に影響を与えることを示しています。およびカンジダアルビカンス 用量依存的に、Au @AgNPsに対してより良い反応を示します

はじめに

過去25年間で、ナノマテリアル合成のためにいくつかの化学的方法が研究されてきました。しかし、これらの方法のほとんどは、環境にやさしい物質を使用し、高温または高価な機器を使用します。この作業では、グリーン合成法を使用して、金-銀ナノ構造の合成を実行しました。この方法は、最初から汚染を最小限に抑えます。「クリーンな」プロセスを使用し、健康や環境に脅威を与えない「クリーンな」ナノマテリアルの開発において、廃棄物のほとんどを回避し、有害な汚染物質を使用します。

金属ナノ粒子のグリーン合成は、生物学的システムとの相互作用のプラスの影響を求めます。つまり、ナノ粒子とポリフェノール分子による自己機能化により、細胞や高分子などのシステムと互換性のある生物学的相互作用が生成されます。一般に、これらの生物学的相互作用は、癌、糖尿病、神経変性疾患などの疾患のナノメディシンとして使用されます。コアシェルシステムとしての銀（シェル）とAuNpsの合成には、光学診断センサー、分子センサー[1、2]、光熱療法、抗菌剤などの用途があり、触媒プロセスを改善します[3,4,5,6]単金属NPを使用。

特に、異なる反応器での連続的または同時的方法、化学的および物理的方法[7]がバイメタル合成に使用されます：超音波スプレー熱分解[8]、ソノケミカル法[5]、マイクロ流体チップ[9]、シーケンシャルナノ流体ナノ沈殿[ 10、11]マイクロエマルジョン[12]、リポソーム[13]、使用される還元剤は化学またはグリーンケミカルタイプです。

乾燥材料は、金属酸化物[14]、カーボンナノチューブ[15、16]、その他の用途の印刷されたソフト電子デバイス[17]としてナノ粒子合成に使用されます。生体系で使用されるウェットナノ粒子[18,19,20]薬物担体[21、22]、抗菌剤[23、24]、センシングアプリケーション[25]、および計算ナノテクノロジーは、用途を定義するために使用される最新の分類[26]です。

Khatami et al。は、特にcore @shellタイプのナノ粒子の植物を使用したグリーン合成をレビューしました。 Antigononleptopus 、カキノキ 、 Azadirachta indica 、 Potamogeton pectinatus 、 Anacadium oceidentale サイズが5〜500nmのAu @ Agナノ粒子の合成（a）については、さまざまなアプリケーション（非抗菌性）および Asparagus racemosus でテストされました。根の抽出物を使用してAu–Ag合金ナノ粒子を合成し、 Escherichia coli でテストした480µg / mLのMICを検出しました。、枯草菌 、クレブシエラ肺炎 、緑膿菌 、および黄色ブドウ球菌 [27]。化学合成によって得られたAu @ Ag NPは抗菌剤としての用途があり、報告されているMICは銀含有量（シェル）で約2.5 µg / mLです[28]、Luet。 al。報告によると、Au / AgNPs @Vanの化学合成はNaBH ₄を使用して調製されましたさらに、グラム陽性菌とグラム陰性菌でテストされたナノ粒子バイメタルのバンコマイシンとMICは60 nmol / mLでした[29]。

バイメタルナノ材料の抗菌特性[30、31、32、33、34]は、Agの濃度の関数として向上します。対照的に、Au濃度の増加は抗菌特性を低下させますが、細胞毒性効果を低下させます。つまり、バイメタル材料はより生体適合性になります[35]。 AuおよびAgの単金属材料の効果を二金属材料と比較すると[36、37、38、39、40]、相乗効果[41]が二金属材料間で発生し、二機能効果を生成することが実証されています[28、42]。

システムを取り巻く化学的環境[43,44,45]（pH、硫黄の存在、生体適合性分子など）が細胞または微生物との相互作用に影響を与えるため、ナノマテリアルの機能化は特に興味深いものです。したがって、グリーンケミストリーを使用して生体材料を生成することに重点が置かれています[46、47、48、49、50、51、52、53、54、55]。

バイメタル粒子の化学組成[56,57,58]は、モノメタルナノ構造の相乗効果[60]により、それらの光学特性[41、59]の決定要因になります。

この作業では、還元剤として Rumex hymenosepalus を使用して、金と銀のナノ粒子を合成しました。抽出物は、金属イオンを還元する強力な抗酸化剤として作用するスチルベンとカテキン分子を含む植物です。金ナノ粒子を核として使用し、連続合成法によりバイメタルナノ粒子コア@シェルタイプのAu @Agを取得しました。ナノ材料の特性評価には、HAADF-STEM、EDS yHRTEMを使用したTEMの手法が含まれます。

さまざまな種類の合成ナノ粒子を使用して、細菌 Eの成長ダイナミクスについて比較研究を実施しました。コリ および S。アウレウス と酵母カンジダアルビカンス。

実験セクション

資料

Rumex hymenosepalus のルーツ地域の商業施設で買収されました。両方の前駆体HAuCl ₄ およびAgNO ₃ ナノ粒子合成用は、99％の純度でSigma-Aldrichから購入しました。微生物アッセイに使用されるブレインハートインフュージョン（BHI）ブロスおよびポテトデキストロースブロス（PDB）は、Sigma-Aldrichから調達しました。ナノ粒子の洗浄プロセスで使用されるエタノール（純度99％）はFermontから入手し、実験では超純水（milli-Q）を使用しました。

Rumex hymenosepalus Extract

抽出物の調製では、150 gの根をスライスに切り、事前に脱水して、1000mLの70 / 30V / Vエタノール/水混合物で浸軟させました。浸軟は、密閉ストッパーを備え、光から保護されたガラス容器内で室温で実施された。得られた溶液の吸光度を、その値に変化がなくなるまで21日間モニターしました。この時点で、浸軟プロセスは終了したと見なされました。得られた抽出物を、孔径8 µmおよび2 µmのワットマンペーパーフィルターで連続的にろ過し、最後に0.22 µmのアクロディスクフィルターでろ過しました。エタノールを回転蒸発により除去し、水性抽出物濃縮物を凍結乾燥のために-80℃で凍結しました（Labconco、FreeZone1L）。得られた粉末は、使用するまで室温で光から保護された滅菌容器に保管されました。

AuNPの合成

まず、 Rumex hymenosepalus 水溶液は凍結乾燥抽出物から10mg / mLで調製しました。後で16mLの Rumex 溶液を32mLの超純水と混合し、1000 rpmで攪拌を続け、16mLのHAuCl ₄をゆっくりと加えました。（0.01 M）。反応は、実験室の照明条件下および室温で１時間保持された。表面プラズモン共鳴の強度（λ _SPR =540 nm）は、UV-Vis分光法によって経時的に評価されました。変化が観察されなかった場合、合成は完了したと見なされました。得られた生成物を12,000rpmで遠心分離し、上澄みを超純水に置き換え、超音波処理プロセスを1時間適用して、ナノ粒子を再分散させました。この手順をさらに3回繰り返しました。最初の2回は水を溶媒として使用し、最後はエタノールを使用しました。最後に、エタノール分散液を遠心分離し、沈殿物を40°Cの対流式オーブンで乾燥させて、2300 µg / mLのAuNPs水性分散液を調製しました。

Au @AgNPsの合成

Au @ AgNPs合成の場合、2 mLのAuNPs水性分散液（2300 µg / mL）、0.8mLのAgNO ₃ （0.1 M）、および0.8mLの Rumex hymenosepalus 溶液（10 mg / mL）を滅菌ガラス培養管に入れました。混合物を超音波洗浄槽（Branson、モデル2510）で3時間超音波処理しました。その後、内容物を12,000 rpmで1時間遠心分離し、得られた固形物を超音波処理によって超純水に再分散させて、1000 µg / mLの濃度にしました。

AgNPの合成

AgNPを生成するために、16 mLの抽出液（10 mg / mL）を64mLの超純水および8mLのAgNO ₃と混合しました。 0.1 M. 25°Cの実験室照明条件下で1時間反応を行い、表面プラズモン共鳴（\（\ lambda _ {{{\ text {SPR}}}} ^ {{{\ text {Ag}} }} \）=440 nm）は、形成を評価するために、UV-Vis分光法によって経時的に監視されました。生成物を12,000rpmで遠心分離し、上澄みを超純水に置き換え、超音波処理を1時間適用しました。この手順をさらに3回繰り返しました。最初の2回は水を溶媒として使用し、最後はエタノールを使用しました。エタノール分散液を遠心分離し、沈殿物を40°Cの対流式オーブンで乾燥させました。最後に、得られたAgNPsダストを超音波処理によって超純水に再分散させ、2000 µg / mLの濃度でコロイド分散液を生成しました。

特性

UV-Vis吸収スペクトルは、デュアルビームPerkinElmer Lambda45分光計で取得しました。 0.5 nmのスリットを使用し、200〜900nmの範囲で480nm / minの速度でスペクトルを記録しました。ナノ粒子の場合、50 µLのサンプルと5 µLの抽出物のみが使用されました。溶媒として超純水を使用して、石英セルで最終容量を3mLにしました。

ゼータ電位（ζ ）AuNPs、AgNPs、およびAu @ AgNPsは、Zetasizer-Nano ZS（Malvern Instruments、UK）を使用して測定されました。各サンプルは、室温（25°C）で3回測定され、各サンプルの1、10、50、および100 µg / mLの濃度の関数として測定されました。

AuNP、AgNP、およびAu @ AgNPのDLSは、633 nm He–Neレーザーを搭載したZetasizer-Nano ZS（Malvern Instruments、UK）を使用して測定しました。各サンプルは、室温（25°C）で3回測定され、各サンプルの1、10、50、および100 µg / mLの濃度の関数として測定されました。多分散度指数（PDI）は、Malvernソフトウェアを使用したDLS実験から、定義\（{\ text {PDI}} =\ left（{\ frac {\ sigma} {{\ overline {D}}}} \ right）^を介して決定されました。 {2} \）、ここで D は平均直径であり、\（\ sigma \）は\（D \）の標準偏差です。 0.10以下のPDI値は、高度に単分散であると見なされます[62]。

光学バンドギャップ E _g は、AgNP、AuNP、Ag @ AuNPについて計算され、Tauc方程式を使用して、次の関係によって材料のバンドギャップを決定します。

$$ \ alpha =\ frac {c} {h \ upsilon} \ left（{h \ upsilon --E _ {{\ text {g}}}} \ right）^ {1 / n} $$（1）

ここで、\（\ alpha \）は材料の吸収係数です（\（\ alpha \）=2.303 A / d ここで、Aは吸光度、dはセルの幅）、ここで E _g は光エネルギーバンドギャップであり、hʋ （αhʋの間に線を引くことによって得られる光子エネルギーです）ⁿ と光子エネルギーhʋ 。インデックス番号nは、サンプルで許可されている直接バンド間遷移の2と見なされ[63]、線形フィットプロット[64]で簡単に評価できます。遷移のタイプに応じて、1 / 2、2、3 / 2、および3の値が、それぞれ許可された直接、許可された間接、禁止された直接、および禁止された間接遷移に対応します[65]。

サンプルAgNP、AuNP、Ag @ AuNP、およびRhは、FTIR（PerkinElmer、Inc.、Waltham、Spectrum Two）を使用した赤外線吸収によって分析されました。取得パラメータは次のとおりです。4cm^-1 解像度、16スキャン、4000〜900 cm ^-1 波長範囲。

X線光電子分光分析は、Mg / Al、300 W、15kVのデュアルソースを含むPerkinElmerモデルPHI5100で実行されました。エネルギー1253.6eVのMgKα輝線は、AgNP、AuNP、Ag @ AuNP、およびRhに使用されました。すべての実験は、2×10 ^–9 の真空条件下で実施されました。トル。 [66]。 Multipakソフトウェアを使用してデータを分析しました。 XPSの特性評価では、さまざまなナノ粒子分散液と Rumex hymenosepalus 抽出液は、次のようにきれいなカバーガラスに沈着しました。 30 µLのサンプルをカバースリップに追加し、次の堆積のために完全に乾燥させました。このプロセスは、薄膜が形成されるまで少なくとも5回繰り返され、その後XPSによって特徴付けられました。

高角度環状暗視野走査型透過電子顕微鏡法（HAADF-STEM）は、電子顕微鏡法の強力な操作モードと見なすことができます。これは、ナノ材料の構造を解明する大量の補足情報を提供します。収差補正されたHAADF-STEMは、異なる化学的性質の原子の位置を原子分解能で決定できます。これは、化学物質過敏症と高い空間分解能で知られる収差補正HAADF-STEMによるものです[67]。この動作モードでは、インコヒーレント画像が支配的であり、回折コントラストの寄与はごくわずかです[68]。したがって、HAADF-STEM収差補正の原子番号コントラスト（Zコントラスト）により、ナノ構造の構造の詳細を非常に正確に決定できます。

STEM分析では、200 kVで動作するJEOL-JEMARM200電子顕微鏡で、コンデンサーレンズ用のCEOSコレクターを使用してサンプルを分析しました。 ZコントラストSTEM画像は、BFモードとHAADFモードの両方で同時に記録されました。画像は、40ミクロンのコンデンサーレンズアパーチャ（32〜36 mradの収束角）と9pAのスポットサイズで記録されました。

電子顕微鏡分析では、Au @ AgNPs懸濁液の液滴（10 µL）を300メッシュの厚さのカーボングリッドに堆積させ、室温まで乾燥させ、真空チャンバーに24時間入れました。

ナノ粒子は、200kVでJeol2010F装置（1.9Å分解能）のTEMによって分析されました。 EDS分析は、XFlash4010検出器を備えたQUANTAX200-TEM X線分光計（Bruker）を使用して実現されました。 HRTEM分析では、TEM顕微鏡写真を100,000倍を超える倍率で記録しました。結晶面の面間隔は、デジタル顕微鏡写真分析（3.0 Gatanバージョン）によって決定されました。サンプル準備は、STEM分析について前述したものと同様でした。

データは、多層ミラーモノクロメーターとCuKαマイクロフォーカスシールチューブ（λ）を備えたBruker D8QUEST回折計システムを使用して収集されました。 =1.54178Å）。フレームは T で収集されました =ω経由で300K / φ -スキャンしてから処理して、強度対2シータの回折図を取得します。ハイスコアプラスソフトウェアを生データ処理に使用し、ソフトウェアに関連付けられたICSD粉末回折データベースを検索一致フェーズ識別分析に実装しました。

抗菌活性アッセイ

テストされた微生物はバクテリア Escherichia coli （ATCC 25922）、黄色ブドウ球菌 （ATCC 5538P）、および酵母カンジダアルビカンス 尿路感染症の成人男性患者から収集された感染尿から分離されました（私たちの研究はヘルシンキ宣言の原則に従います）。ブレインハートインフュージョン（BHI）とポテトデキストロースブロス（PDB）を使用して、それぞれ細菌と酵母の接種材料を調製しました。培養物を37℃で一晩インキュベートした。懸濁液1ミリリットルあたりのコロニー形成単位（CFU / mL）での濃度は、細菌の場合は540 nm、酵母の場合は600nmでUV-Visによる光学密度を測定することによって決定されました。 4×10 ⁸ を含む懸濁液、7.8×10 ⁸ 、および2.5×10 ⁶ EにはCFU / mLを使用した。コリ 、 S。アウレウス 、および C。アルビカンス 、それぞれ。抗菌活性は、ナノ粒子と微生物を添加した液体培地を37ºCで使用して、96ウェルプレートでテストしました。すべてのテストは3回実行されました。吸光度は、マルチモードプレートリーダーSynergy HTX Biotekで、Gen5ソフトウェアを使用して測定しました。すべての微生物増殖曲線は、Origin Lab8.0ソフトウェアを使用して実行されました。最初のステップとして、必要な濃度のナノ粒子と混合した70 µLの新鮮なブロス培地（調査対象の微生物に応じてBHIまたはPDB）をウェルに添加しました。その後、30 µLの微生物懸濁液をウェルに加え、培地でホモジナイズしました。各ウェルの最終容量は100µLでした。接種物を分注した後、96ウェルプレートを上記の分光光度計で読み取った。プレートを37°Cで24時間保持し、各読み取りの前に、それぞれ15分の周期で円形振とうモードを使用しました。微生物の増殖速度は、上記の波長での光学密度測定（OD）によって決定されました。

ゴンペルツモデルによって分析された曲線の成長

ゴンペルツ成長モデルが微生物集団の成長をよく説明していることは、文献でよく知られています。このモデルにより、微生物集団の成長を説明する上で、適応期（ラグ期）と集団成長率という2つの重要なパラメーターを理解することができます。特に、微生物の抑制的処理におけるラグ相の挙動の研究は、処理に対する微生物の適応応答に関する情報を提供し、評価された処理に対する微生物の耐性の発達についての指標を与えることさえできるため、関連性があります[69 ]。

修正されたゴンペルツモデルは、Zwietering etal。によって記述されています。 [70]そしてLiらによって適応されました。 [69]および他の著者[71,72,73,74,75,76,77,78]は、成長曲線を調整するモデルとして、

$$ y =A \ exp \ left \ {{-\ exp \ left [{\ frac {\ mu e} {A} \ left（{\ lambda --t} \ right）+ 1} \ right]} \ right \} $$（2）

ここで A OD ₅₄₀として表される細胞数です（黄色ブドウ球菌 および E。コリ ）およびOD ₆₀₀ （ C。アルビカンス ）、μ は指数関数的成長率であり、 e は指数関数的な e ¹ 、\（\ lambda \）はラグフェーズです。 Sに対する影響を分析するために、ソフトウェアオリジン9.1を使用して成長速度を調整しました。アウレウス 、 E。コリ、 および C。アルビカンス 3つのエージェントAuNPs、AgNPs、およびAu @AgNPsの。

Eに対するナノ粒子の影響。コリ、、 S。アウレウス、および C。アルビカンス成長

大腸菌 および黄色ブドウ球菌 BHI培地に接種し、 C。アルビカンス PDブロスに接種されました。すべての培養物を36℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、3つの培養物をそれぞれ1、0.7、および1の吸光度に調整した（λ =540 nm）。 AuNP、AgNP、およびAu @ AgNPは、50 µg / mLの濃度に調整されました。 96マイクロウェルプレートでは、調整された培養物が7：3の関係でナノ粒子に曝露され、各マイクロウェルの最終容量は200 µLに達しました。また、調整された培養物は、以前に記載されたのと同じ条件で、対照条件として滅菌水に曝露された。この実験に使用された他のコントロールは、新鮮な培地と微生物を含まない各ナノ粒子溶液でした。 大腸菌、黄色ブドウ球菌 、およびカンジダアルビカンス それぞれAuNP、AgNP、およびAu @AgNPにさらされました。マイクロウェルプレートを36℃でインキュベートし、処理および対照条件の各微生物のサンプルを1、7、13、および19時間で取得しました。収集したサンプルを1:10の生理食塩水で希釈し、ミューラーヒントンプレートの表面に広げました。接種したプレートを36℃で24時間インキュベートしました。インキュベーション後、CFU / mLは直接カウントを使用して計算されました。

最小殺菌濃度（MBC）の決定

黄色ブドウ球菌 、 Escherichia coli 、およびカンジダアルビカンス それぞれをミューラーヒントン培地に接種し、36℃で一晩インキュベートし、0.5マクファーランド比濁計に調整しました。最小発育阻止濃度（MIC）を決定するために接種材料を調整したら、微量希釈試験を実施しました。簡単に説明すると、この目的のために96ウェルプレートを使用しました。各微生物の調整培養液160µLを5つのウェルに注ぎました。 1000 µg / mLのAuNP、AgNP、およびAu @AgNPの溶液を調製しました。以前のソリューションは、750、500、および250 µg / mLソリューションの準備に使用されていました。純粋な滅菌水を0µg / mLのナノ粒子として使用し、以前の各溶液40 µLを調整済み培養液160 µLに添加しました。このようにして、各培養物は、テストされた各ナノ粒子の最終濃度200、150、100、50、および0 µg / mLにさらされました。マイクロプレートを36℃で24時間インキュベートしました。その後、各ウェルのサンプルをミューラーヒントンの表面に接種し、前述の同じ条件でインキュベートしました。インキュベーション後、ミューラーヒントンプレートが成長シグナルを探しているのが観察されました。成長シグナルが観察されなかった濃度をMBC値として記録しました。

結果と考察

特性評価

図1aは、合成されたナノ材料のUV-vis吸収スペクトルを示しています。吸光度は、各ナノ粒子システムに対応する最大局在表面プラズモン共鳴（LSPR）に対して正規化されています。

図1aのAu @ AgNps吸収スペクトルには、AgNPs LSPR（445 nm）とAuNPs LSPR（544 nm）の間に位置する474nmを中心とする単一のバンドがあります。 Au @ AgNPsに金のような吸収ピークがないことは、連続合成によって得られたナノ材料がコア@シェル構造であることを示唆しています。原子核に属するAuに関連する吸収帯を検出することはできません。一部の著者は、core @ shellシステムの場合、吸収スペクトルは、シェルの厚さが3〜4nmの各金属に関連付けられた2つのバンドで構成されていると想定しています。メタルコアに関連する吸収は、厚みが増すと消え、最大位置がバイメタル粒子の厚み/コアサイズ比に依存する単一の吸収帯が得られます[79、80]。

サマル等。 [81]核のサイズを制御し、異なる厚さのシェルを追加することにより、core @ shellナノ粒子（Au @ Ag）を合成しました。特に、Au @ AgNPのUV-visの結果は、Samal etalによって報告された結果と一致しています。 32nmの金のコアと15nmを超える銀の厚さの場合、スペクトルは単一の吸収帯（〜450 nm）によって特徴付けられ、Au表面プラズモンの抑制が観察されます。

さらに、図1aでは、 Rumex hymenosepalus の分子に対応する、280 nmを中心とする吸収（青色で強調表示された領域）を観察できます。ナノ粒子合成で還元剤として使用される抽出物。追加ファイル1：図S1は Rumex hymenosepalus に対応します水溶液の吸収スペクトル。ポリフェノール化合物のカルボニル基と共役した芳香族環の電子遷移に関連する、278nmを中心とする特徴的なバンドが観察されます[82]。ナノ粒子のUV-Visスペクトルのこの吸収帯は、最終製品に抽出分子が残っていることを示しています、Rivero-Cruz etal。 al。 Rから単離された4つのスチルベノイド、2つのフラバン-3-オール、および3つのアントラキノンが報告されています。 hymenosepalus [83]およびRodríguez-Leónet。 al。 Rumex hymenosepalus を決定するために、核磁気共鳴研究を実施しましたスチルベン配糖体、没食子酸エピカテキン、没食子酸エピガロカテキンなどの重要な分子が含まれています[61]。これらの分子は、ナノ粒子合成の還元剤として関与します。このプロセスでは、フェノール環のいくつかの-OH基を脱プロトン化して=CO基を形成します。ポリフェノール分子が酸化され、放出された電子がAg ⁺ に移動します。およびAg ³⁺ Au ⁰ を形成するイオンおよびAg ⁰ 。

図1bは、1、10、50、および100 µg / mLの濃度でのAuNP、AgNP、およびAu @AgNPに対応するゼータ電位値を示しています。ナノ粒子を超純水に分散させ、25℃で3回測定した。一般に、濃度範囲全体で、ナノ粒子は-30 mVよりも負のゼータ電位値を示し、AuNPおよびAu @AgNPの場合は100µg / mL、AgNPの場合は-38mVの濃度で-40mVの値に達します。これらの非常に負のゼータ電位値は、ナノ粒子がそれらの間の反発相互作用を経験し、それらの凝集を防ぎ、金属コロイドの長期安定性を可能にすることを示しています[84,85,86]。 UV-Vis分光法の結果を、得られたゼータ電位値と相関させることにより、非常に負の値が、抽出物のポリフェノール分子のナノ粒子表面への錯化に起因する可能性があることを確認できます[87]。

生物学的用途では、単分散サイズのナノ粒子集団を取得することが重要です[88]。したがって、図1cおよびdは、AuNP、AgNP、およびAu @ AgNPの濃度での平均直径および多分散度指数（PDI）に対応するDLS値を示しています。 1、10、50、および100 µg / mL。 Au @AgNPの平均直径は約250nmであり、濃度の関数として一定に保たれます。これは、AuNPとAgNPの平均直径がそれぞれ約122nmと135nmの単金属ナノ粒子の場合と同様です。同じケースで、値PDIが単金属ナノ粒子で約0.3、Au @AgNPで0.2であることに注意してください。サイズが濃度によって変化しないこれらの結果は、異なるナノ粒子システムが良好な安定性を示し、サイズの適度な多分散性（0.3≥PDI≥0.2）を示すことを示しています。

Taucプロットの光学バンドギャップが計算されました（追加ファイル1：図S2）。半導体材料による伝導帯の値は E _g <3 eV、参照ゲルマニウムには E _g <0.7eVおよびシリコンは E _g =1.1 eV [89]。この場合、Au @ AgNP、AuNP、およびAgNPのバンドギャップは、それぞれ1.93 eV、2.03 eV、および2.33eVです。これは、これらの材料が半導体のように考えられていることを意味し、この機能は、エネルギーギャップを拡大する量子閉じ込め効果のために得られたものであるため、ナノ材料はセンサー、バッテリー、およびオプトエレクトロニクスデバイスとして使用できます[64]。

有機化合物がナノ粒子に存在するかどうかを確認するために、これらのナノ材料はXPSとFTIRによって特徴づけられました。図2aは、植物抽出物とナノ粒子の調査スペクトルを示しています。ご覧のとおり、すべてのナノ粒子システムは、 Rumex hymenosepalus からの炭素（C 1 s、284.6 eV）および酸素（O 1 s、532.2 eV）の元素に関連する特徴的な信号を示します。エキス。この結果は、抽出物からの有機分子が得られたナノ材料に存在することを確認します。さらに、ナノ粒子中の銀と金の酸化状態を分析するために、高分解能XPSスペクトルが取得されました（追加ファイル1：図S3）。 AgNP（追加ファイル1：図S3A）の場合、3d3 / 2および3d5 / 2スペクトル線に対応する373.76eVおよび367.76eV（∆BE =6.0 eV）の結合エネルギーでの信号をAg ^{0に関連付けることができます。} （メタリックシルバー）。 AuNP（追加ファイル1：図S3B）の場合、4f5 / 2スピン軌道相互作用に関連するピークは結合エネルギー87.65eVにあります。 4f7 / 2の場合、スピン軌道相互作用のピークは83.98eVにあります。強度の比（I4f7 / 2> I4f5 / 2）、位置、およびピーク間の分離（ΔBE=3.67 eV）により、金イオン（Au ³⁺ ）が確認されます。）完全に金属金に還元されますAu ⁰ [90]。 Au @ AgNPの場合、銀と金に対応する高分解能XPSスペクトルは、それぞれ追加ファイル1：図S3Cと図S3-Dに示されています。これらのスペクトルは、対応する単金属と同じ動作を示します。これは、core @shellプレゼンテーションで銀と金の両方がゼロ価であることを示しています。

図2eのFTIRは、3296 cm ^-1 で示しています。ヒドロキシル基、2974 cm ^-1 （C–H）芳香環の結合、1689 cm ^-1 カルボニル基の伸縮（C =O）に関連し、1689〜1400 cm ^-1 カルボン酸塩結合（C–O）と伸縮性炭素-炭素結合および1212 cm ^-1 による AuNPと結合したフェノールC–O伸縮に関連、1049 cm ^-1 カテキンエステル基分子のC–Oストレッチモード[88,89,90]および799 cm ^-1 フェノールの平面からの曲げ、964.4で報告されたC–H曲げ、および829.39 cm ^-1 レスベラトロールの特徴[91]は、Rh抽出物で1031および867 cm ^-1 にシフトしました。、それぞれ、AuNP、AgNP、およびAu @ AgNPもシフトしており、Rh抽出物の分子ポリフェノールとナノ粒子の複合体形成を示しています。

図3aは、低倍率（100 nmスケールバー）でのAu @AgNPsシステムの代表的な明視野STEM顕微鏡写真に対応しています。凝集がなく、ほとんどが準球形のナノ粒子のセットを見ることができます。同じ領域が図3bの暗視野（HAADF）に示され、core @ shell構造が観察されます。ここで、原子番号の違いにより、Au-coreがAg-shellよりも強く見えることを区別できます。図3cとdは、それぞれ明視野と暗視野でのシステムcore @ shellのナノ粒子グループのSTEM高倍率顕微鏡写真（スケールベア20 nm）に対応しています。透明感のある鮮やかなAuコアとAgシェルが軽くコントラストを成して鑑賞できます。これらの画像は、Agシェルの厚さが3〜5nmの間で変化することを示しています。追加ファイル1：図S4は、Agシェルの均一性を観察できる個々の画像ギャラリーに対応しています。

図4a、c、およびeは、それぞれ代表的なナノ粒子システムAuNP、AgNP、およびAu @AgNPの顕微鏡写真TEMに対応しています。すべての場合において、ナノ粒子は球のような形態をしており、互いに十分に分離されていることが示されています。これは、ナノ粒子表面への抽出分子によって説明でき、それらの間のスペーサーとして機能します。図4b、d、およびfは、TEMによって取得され、各ナノ材料の15〜20枚の顕微鏡写真から収集された500個のナノ粒子で実行されたサイズ分布に対応するヒストグラムを示しています。ヒストグラムは、平均サイズが24±4 nm（AuNPs）、13±3 nm（AgNPs）、および36±11 nm（Au @ AgNPs）のガウス分布を示しています。サイズ分布グラフを使用したDLSとTEMの測定値の不一致は、ナノ粒子の周囲の微小環境の条件によるものですが、DLSは、金属、水和コーティング、および溶媒を含むシステムの直径を示しています。TEM測定の比較では、乾式システムです。測定が金属のみで行われる場合、特にDLSでは、ナノ粒子の錯化に使用される分子（還元剤と安定剤）は分散剤であり、サイジング測定でエラーを引き起こし、結果をより高い値にシフトします[91]。

図5は、Au @ AgNPsHAADF-STEM顕微鏡写真に対応しています。図5aに、金の核と銀のカバーが完全に区切られた単一のナノ粒子を示します。原子番号（Z）は、Au @ Agのインターフェイスを介して変化し、強度の変化はHAADF-STEMによって定量化できます[67]。

赤い四角の領域を増幅してシェル部分のHRTEM顕微鏡写真を取得し（図5b）、結晶性のシェル構造を確認するために、Digital Micrograph 3.0ソフトウェア（Gatan）を使用してナノ粒子の周辺領域を分析しました（四角は廃止）。選択した領域の高速フーリエ変換（FFT）画像が取得されました（図5c）。逆高速フーリエ変換を使用すると、図5dで2.3Å、2.0Å、1.4Åの面間距離を推定できました。これらの距離は、FIZ Karlsruhe–Leibniz Institute forの無機結晶構造データベース（ICSD）に従って、面心立方（fcc）銀の結晶面（111）、（200）、および（220）にそれぞれ割り当てることができます。情報インフラストラクチャ、ドイツまたは電子結晶学ソフトウェアJems（V 4-5430、JEMS-SAAS、スイス）[92]。追加ファイル1：図S5（AuNPの場合）およびS6（AgNP）に示すように、HRTEMによる結晶構造の同様の分析が単金属ナノ粒子に対して実行されました。どちらの場合も、結晶構造は面心立方（fcc）に対応します。

EDS化学分析は、TEMによって観察されたバイメタルAu @ AgNPのグループ（図6a）の両方の金属の存在を、Ag（シェル）の77％とAu（コア）の23％の原子量パーセントの割合で示しています（図6a）。 6b）。比較すると、単一のバイメタル（図6c）のAu @ AgNPは、Ag（シェル）の約80％とAu（コア）の20％の比率を持っています（図6d）。 core @ shellナノ粒子（Au @ Ag）の金と銀の原子パーセンテージを推定するために、ナノ粒子の形態の準球面幾何学近似が考慮されました。 TEMサイズ分布（\（\ overline {D} _ {{{\ text {Au}}}} =24 \; {\ text {nm}} \））から得られたAuNPの平均直径は、コアボリュームの推定に使用されました（ V _Au ）、およびAu @ AgNPsの平均直径\（\ left（{\ overline {D} _ {{{\ text {Au}} @ {\ text {Ag}}}} =36 \、{\ text {nm}} } \ right）\）core @ shellボリューム推定用\（（V _ {{{\ text {Au}} @ {\ text {Ag}}}}）\）。したがって、シェルの体積は\（V _ {{{\ text {Ag}}}} =V _ {{{\ text {Au}} @ {\ text {Ag}}}} --V _ {{{\ text { Au}}}} \）。 AuとAgの総原子含有量は、AuとAgの格子定数がそれぞれ4.0783Åと4.0862Åであるブース金属のfcc結晶構造（単位セルあたり4原子）を考慮して計算されました[93]。この手順による原子含有量の推定は、Ag（シェル）と30％Au（コア）で70％であり、EDSで得られた測定値とは10％異なります。図7は、銀と金の含有量の理論的推定と、シェルの厚さが増加し、コアのサイズが一定に保たれるにつれてどのように変化するかを示しています（\（\ overline {D} _ {{{\ text {Au}}}} =24 \; {\ text {nm}} \））。直径が30.2nmを超えるAu @ AgNPの場合、銀の原子含有量が金の含有量を超えることが観察されています。補足資料では、原子含有率を得るために計算の詳細な説明が行われます。他のAuコアの直径とさまざまなAu @ AgNPsの直径を考慮して、原子パーセンテージの同様の推定を実行しました（追加ファイル1：図S7A-B）。

図8は、AuNPとAgNP、およびバイメタルAu @AgNPのXRDパターンに対応しています。合成されたすべての生成物は、電子顕微鏡による特性評価で以前に報告されたように、fcc結晶構造を持っています。 Au @ AgNPのピークは、38.25°、44.4°、64.9°、77.85°、および81.25°の2θ回折角にあります。図からわかるように、AgNPとAuNPの回折ピークは、上記の同じ位置に±0.5°の差で見られます。これは、AuとAgの格子定数が非常に似ているため、fcc結晶構造の回折パターンがほぼ同じであるためです[94,95,96]。このように、図8の回折ピークは、JCPDSによって金と銀のfcc構造の結晶面（111）、（200）、（220）、（311）、および（222）にそれぞれ割り当てられます。 4-0783および4-0784 [97]。

抗菌作用

モノメタリック（AgNPs、AuNPs）およびバイメタル（Au @ AgNPs）材料は、1、10、50、および100μg/ mLの4つの異なる濃度でテストされました。抗菌活性を評価するために選択された微生物は、酵母カンジダアルビカンスでした。、グラム陽性菌黄色ブドウ球菌 、およびグラム陰性菌 E。コリ 。 24時間の時間経過における成長速度曲線を図9に示します。

カンジダアルビカンス

AuNPは、10時間まで成長速度に影響を与えず（図9a）、24時間で吸光度が到達するまで用量依存的に変化します。興味深いことに、50 µg / mL以上の場合、成長速度は10時間から24時間で45％の減少に達するまで急な負の勾配を示します。これは、これらの材料の抗真菌効果を示唆しています。これは、金ナノ粒子がH ⁺ などの真菌に存在する関連タンパク質と相互作用する能力に起因する可能性があります。 -ATPase、プロトンポンプ活性に影響を与えます。これは、酵母がその死を引き起こす栄養素を取り込む能力を萎縮させます[61]。図9bおよびcでは、AgNPおよびAu @AgNPが酵母 Candida albicans の増殖を阻害することが観察されました。 10 µg / mLから。 MIC ₅₀の決定両方の物質の濃度は、追加ファイル1：図S8に示されている用量反応曲線から推定されました。 MIC ₅₀ コントロール（処理なしの酵母）に関する吸光度を50％減少させるナノ粒子の濃度として定義されます。 AgNPおよびAu @ AgNPの場合、MIC ₅₀ それぞれ2.21µg / mLと2.37µg / mLでした。

ただし、EDSの結果（図9b）によると、Au @ AgNPsの銀含有量は64.85％の質量です。したがって、MIC ₅₀のAu @ AgNPsの銀濃度 1.53 µg / mLであり、AgNPの場合よりも30％低くなっています。パドモスらal。銀ナノ粒子は重要な抗菌機能を備えていますが、哺乳類細胞によって細胞毒性があることを示しています。この効果は、バイメタルナノ粒子を使用すると、特にバイメタルナノ粒子のコアに金を使用すると減少します[35]。

Escherichia coli

図9dでは、AuNPは有意な阻害（<15％）を示さず、 Eの成長速度に影響を与えません。コリ 。低濃度のAgNP（図9e）の場合、ラグフェーズは変化しませんが、勾配の減少によって示される成長率の著しい減少があります。 50 µg / mLでは、ラグフェーズは最大16時間続き、生存率は24時間で最大20％に達します。 100 µg / mLの場合、微生物の増殖期の明らかな剥離は観察されません。 Au @ AgNPs（図9f）では、最初の2つの濃度は成長フェーズの変化を示していませんが、コントロールと比較して最大2時間のフェーズ遅延が観察されます。ラグフェーズは50µg / mLの濃度で最大21時間続くことに注意してください。最終的に、100 µg / mLの濃度では明確な成長挙動はありません。

黄色ブドウ球菌

Sの場合、Au（図9g）、Ag（図9h）、およびAu @ AgNP（図9i）について、12時間後に遅滞期の再成長の比較分析が行われました。アウレウス 50 µg / mLで。 100 µg / mLの最高濃度では、バクテリアの増殖はありません。さらに、1および10 µg / mLで、Au、Ag、およびAu @AgNPのリスペクトコントロールの傾きの変化を観察します。

これらのグラム陽性菌とのAuNPの相互作用は、静電相互作用を引き起こし、膜構造を不安定にする帯電した表面が原因である可能性があります。同様の結果が、NP濃度が高いものの、還元剤としてアナナスコモサス果実抽出物を使用して合成されたAuNP [98]および藍藻スピルリナプラテンシスについて報告されています。タンパク質[99]。ヤンら。 SのMIC> 500 µg / mLを表示します。アウレウス （CMCC（B）26003）、当社のAuNPは、10分の1の濃度で阻害を示しました。この場合、ナノ粒子の表面のコーティングと安定化において、ポリフェノール分子との重要な相乗効果が存在します[100]。 ROSは、AuNP、ポリフェノール（植物抽出物）、およびAgNPによって低強度から高強度で生成されるため[101]、レスベラトロールおよびエピガロカテキンガレート（EGCG）と相乗効果のあるAuNPは、 Sよりも抗菌反応を促進します。アウレウス [102]は、この場合、最も実行可能なメカニズムを持っていました。ペンダーズら。 Sで250および500µg / mLのAuNPsのような抗菌剤が報告されました。アウレウス 細菌の増殖遅延時間と抗菌効果の増加[61、98、99]。

阻害は、細菌の膜との静電相互作用[104]を促進し、より高い浸透と損傷をもたらすNPの表面電荷に関連する細菌へのAgNP [103]の蓄積と拡散によって引き起こされると考えられます。これは、 E間の相互作用について説明したのと同様のメカニズムであると考えています。コリ バイオフィルムとAgNps [105]。

Au @ AgNPの場合、得られた結果は他のワークグループによって報告された結果と同等です[100、101]。しかし、異なる著者は、微生物の成長の阻害が殻の厚さに直接関係していることを示唆しています[100、101]。コアシェルNPは、NIH-3T3線維芽細胞（正常な哺乳類細胞）でテストした場合、低い細胞毒性を示しました[35]。 Au @ AgNPsのシェル内の銀の割合が低いと、AgNPs [100]と同様の結果が示され、Auコアは抗菌効果を発揮し、細胞毒性を最小限に抑えます。

修正されたゴンペルツモデルによって分析された曲線の成長

成長率（ µ ）およびラグフェーズ（λ ）が定量的に変更され、さまざまな濃度のナノマテリアルに曝露された微生物の増殖曲線（図10）がゴンペルツモデル（式2）によって調整されました。

図10aでは、すべてのナノマテリアルが Sの複製率の低下をもたらすことがわかります。アウレウス ナノ粒子の濃度が増加したときの集団。この効果により、AuNPの感度がわずかに高くなります。 50 µg / mLの濃度では、コントロールに関して成長率はわずか30％です（追加ファイル1：表S1〜S24）。 100 µg / mLの濃度では、すべての材料が Sの成長を阻害します。アウレウス 人口。 Sの適応フェーズの動作。アウレウス さまざまな処理を行った場合の図10bを示します。使用する材料に大きな違いはなく、50 µg / mLでは、 Sの適応相と比較してラグ相がほぼ5倍に増加していることが観察されます。アウレウス （追加ファイル1：表S1〜S24）。一般に、 Sで評価されたさまざまなナノマテリアルを確立することができます。アウレウス 複製速度を低下させ、100 µg / mLで阻害されるまで、用量依存的に適応期を延期します。

図10cは、AuNPが成長率 µ に影響を与えないことを明確に示しています。 Eのコリ バクテリア。一方、AgNPは µ を超える減少をもたらします、コントロールの19％に対応する最小値に達します（ µ E.coli の場合処理なし）50 µg / mLの場合（追加ファイル1：表S52を参照）。対照的に、Au @AgNPは Eを完全に阻害します。コリ 100 µg / mLでの増殖。 Eの振る舞いの分析。コリ さまざまな材料にさらされた遅滞期を図10dに示します。この場合、図10bとは異なり、各材料には特徴的な応答があります。したがって、AuNPは、 Eの適応フェーズで変更を生成しません。コリ 、AgNPsとAu @ AgNPsはLag相に用量依存的な影響を及ぼしますが、後者の材料は際立っています。したがって、AuNPが Eに感知できるほどの影響を及ぼさないことを確認できます。コリ バクテリア、およびAu @ AgNPは複製を阻害する可能性があるため、 Eのラグフェーズを無期限に延期します。コリ 。興味深いことに、正味の銀含有量がAu @ AgNPよりも高い場合でも、この効果はAgNPでは達成されません。これは、両方の金属のcore @ shell提示が、抗菌活性に有利な相乗効果を生み出すことを示唆しています。 Fenget。 al。は、コアシェルおよび合金構造におけるAuからAgへの電子補償現象を報告しています。これは、ナノ粒子の細胞毒性を強化することに由来しますが、抗菌特性を維持します。つまり、AuとAgの間に観察された違いにより、AuとAgの相乗効果が想定されます。モノメタリックおよびバイメタル材料[106]ですが、さらに研究が必要です。

図11は、ナノマテリアルに曝露された微生物のコロニーの直接カウント研究の結果を示しています。一般に、微生物集団の行動は、成長速度論研究から得られた結果を再現します（図7a、e、i）。たとえば、図11aでは、微生物の個体数（対数で表される）は、AuNPが Cの92％を殺した19時間でのみ大幅に減少します。アルビカンス 。興味深いことに、銀を含むナノ粒子の場合（図11b、c）、より顕著な人口減少が観察されます。 50 µg / mLのAu @ AgNPsシステムは、ほぼ完全に Sを阻害します。アウレウス 7時間後（細菌の99.5％が死滅）、微生物はその後の成長を再活性化します。実験的観察によると、この効果を示すには、より高い濃度が必要であるため、MBCの決定はテストされた濃度では取得できませんでした（追加ファイル1：図S9-11）。ただし、 Cの場合。アルビカンス 、AgNPは50 µg / mLのMBC値を示しました（追加ファイル1：表S55）。

結論

初めて、 Rumex hymenosepalus を使用して、金ナノ粒子とcore @ shell（Au @ Ag）の生成が報告されました。還元剤としての根の抽出物。 Au @ AgNPsを取得するために、中程度の多分散性と均質な銀シェルを備えた粒子を生成する2段階の順次法が提案されています。ゴンペルツモデルを通じて得られた成長曲線とそのパラメータの決定は、評価された微生物に対するナノマテリアルのさまざまな影響を示しています。 Sに対するAuNPの阻害効果。アウレウス 異なるプロセスで合成された他のAuNPについて報告するために、5分の1の濃度で到達します。これは、従う合成プロセスの重要性とナノ粒子の表面の環境を明らかにしています。一方、AgNPとAu @ AgNPは、ラグフェーズの大幅な成長をもたらします（> 12時間）。しかし、バクテリアはこれらの抑制性以下の濃度で適応し、成長を開始する可能性があり、その結果、これらのナノ材料に対する耐性を生み出すリスクがあります。これは、遅延した成長を破棄するための適切な期間をカバーする成長速度論研究を実施することの重要性を強調しています。興味深いことに、ゴンペルツの分析は、Au @ AgNPが、単金属ナノ粒子によって示されるよりも微生物の成長速度に高い影響を与えることを示しています。これは、core @shell構造に対する両方の金属の相乗効果に起因する可能性があります。殺菌効果は Cでのみ達成されます。アルビカンス AgNPにさらされます。研究対象の微生物のMBCを決定するには、これらのナノマテリアルのより高い濃度範囲（> 200 µg / mL）でさらに実験を行う必要があります。