マルチウォールカーボンナノチューブが一酸化窒素シグナル伝達を介してトマト側根形成を促進するメカニズム

概要

マルチウォールカーボンナノチューブ（MWCNT）が植物に毒性を示すことは多くの研究で明らかにされています。しかし、根系の様々な環境シグナルへの適応性の重要な構成要素である側根（LR）形成にMWCNTが影響を与えるか、またどのように影響するかについては議論が分かれています。本報告では、MWCNTがトマト実生根内に取り込まれることを発見しました。MWCNT投与は、概ね用量依存的にトマト側根形成を促進しました。内因性一酸化窒素（NO）生成はMWCNTにより誘発され、グリース試薬法、電子スピン共鳴（EPR）、レーザー走査共焦点顕微鏡（LSCM）、およびNOスカベンジャーにより確認されました。MWCNT誘発性NO合成と側根形成が、内因性NOをそのスカベンジャーで除去することで明確に阻害されたため、MWCNTとNOの間に因果関係が存在します。硝酸還元酵素（NR）の活性はMWCNTに応答して増加しました。NR阻害剤であるタングステートによる阻害は、NO生成を損なうだけでなく、MWCNTによって誘発された側根形成も消失させました。哺乳類型一酸化窒素シンターゼ（NOS）様酵素阻害剤であるN^G-ニトロ-L-アルギニンメチルエステル（L-NAME）の添加は、側根形成に影響を与えませんでした。総合すると、NOがMWCNTによる側根形成制御における下流シグナル分子として、少なくとも部分的にはNRを介して作用する可能性を提案します。

はじめに

カーボンナノチューブには多くの生物学的および医学的応用があります[1, 2]。細胞膜を容易に透過する独自の能力により、カーボンナノチューブの生物安全性は常に議論の的となっています[3, 4]。一方、カーボンナノチューブの生産と使用が急速に拡大しているため、ヒトや哺乳類、そして最近では植物におけるその細胞毒性の詳細なメカニズムを解明することが重要になっています[3,4,5,6,7,8,9]。植物とその群集がヒトと環境にとって非常に重要であり、バイオソリッド肥料施用による土壌蓄積を通じてカーボンナノチューブ曝露のリスクにあることはよく知られています[6, 10, 11]。カーボンナノチューブの重要なメンバーとして、グラフェンの複数層が巻かれた構造を持つマルチウォールカーボンナノチューブ（MWCNT）の毒性は広く調査されてきました。哺乳類での研究では、MWCNTと単層カーボンナノチューブの曝露がヒト角化細胞とA549細胞で酸化的損傷とNF-κB活性化を誘発することが明らかにされています[9, 12]。MWCNTと単層カーボンナノチューブは細胞膜と融合し、脂質過酸化と酸化ストレスを通じて細胞損傷を引き起こします[9, 11, 13, 14]。ヒト臍帯静脈内皮細胞では、MWCNTによる細胞毒性と酸化ストレス、および穏やかな炎症反応が観察されています[15]。先行研究では、MWCNTのレッドスピナッチにおける主要毒性は主に活性酸素種（ROS）過剰生成に由来し、アスコルビン酸補給で毒性効果が逆転することが示唆されています[7]。この意味で、MWCNTは動物や植物において生物にとって新たなストレス因子と見なされています。

側根（LR）形成は根系構造の重要な決定因子であり、様々なストレスへの適応応答の指標と見なされてきました[16]。高等植物では、LR形成は植物ホルモンと、水分利用可能性、栄養素、低酸素や重金属ストレスなどの非生物的ストレスを含む幅広い環境シグナルによって影響を受けます[17,18,19]。一方、十分な証拠が、LR形成が物理的支持としてだけでなく、植物成長発育のための水分と栄養素吸収にも寄与することを確認しています[19,20,21]。異なる環境手がかりはいくつかの特定のストレス誘導形態形成応答（SIMR）表現型を引き起こし、LR形成促進と主根伸長抑制を含みます[17]。LR形成の制御はまた、オーキシンなどの植物ホルモンによって厳密に制御され、オーキシン応答による細胞周期制御遺伝子の活性化が示唆されています[19, 22]。一方、キュウリ、トマト、ダイズ、ナタネ植物において、オーキシン誘導根器官形成におけるいくつかの小分子の関与が確認されています[23,24,25,26,27]。これらの小分子には過酸化水素（H₂O₂）、一酸化窒素（NO）、一酸化炭素（CO）、水素ガス（H₂）が含まれます。

これらの中で、フリーラジカルガスであるNOは植物において多くの生理機能を持つことが示されています[28, 29]。ストレスに対する植物適応の増強に加え、NOの機能には根毛発達促進、不定根形成、側根形成促進が含まれます[30,31,32,33]。ただし、上記プロセスにおけるNO生合成の酵素的源は不明のままです。動物では、ヘム含有酵素一酸化窒素シンターゼ（NOS）によりL-アルギニンからNO合成が触媒されます[34]。NOS遺伝子は植物で同定されていませんが、哺乳類型NOS様活性は広く検出されており、哺乳類NOS阻害剤であるN^G-ニトロ-L-アルギニンメチルエステル塩酸塩（L-NAME）が植物でNO生成を阻害できます[25, 33, 36,37,38,39]。重要なことに、豊富な遺伝的証拠により、NOが植物における窒素代謝を担うよく知られた酵素である硝酸還元酵素（NR）によって生成されることが明らかにされています[28]。NR依存的NO生成の気孔閉鎖と寒順化への関与が遺伝的に実証されています[37, 38]。我々の先行研究では、NR依存的NO合成がオーキシン誘導水素ガス媒介側根形成に関与することを示しました[39]。

現在まで、ナノ材料（MWCNT[40,41,42,43]、金ナノ粒子（Au NP[44]）、酸化亜鉛ナノ粒子（ZnO NP[45, 46]）、酸化チタンナノ粒子（TiO₂ NP[46]）、グラフェン酸化物（GO[47,48,49]））で補充した際、様々な植物種でLR形成の促進または抑制といった異なる応答がそれぞれ報告されています（表1）。しかし、上記応答におけるNOの役割を決定的に証明した研究はまだありません。本研究では、グリース試薬法、レーザー走査共焦点顕微鏡（LSCM）、電子スピン共鳴（EPR）解析による内因性NO検出により、MWCNT処理トマト実生でNOレベルが増加することを明らかにしました。その後、側根形成を観察しました。NOスカベンジャーとNRおよび哺乳類型NOS活性を阻害する拮抗薬を用いて内因性NOレベルを操作することで、MWCNT誘導側根形成におけるNOの関与をさらに研究しました。さらなる実験により、NR依存的NOがMWCNT応答側根形成に少なくとも部分的に不可欠であることが明らかになりました。この研究は、植物におけるナノ材料の生物学的効果理解への新たな窓を開くものです。

材料と方法

化学薬品

特に記載がない限り、その他すべての化学薬品はSigma-Aldrich（St Louis、MO、USA）から入手しました。MWCNTはSigma-Aldrichから購入し、先行報告[50]で特性評価済みです。MWCNTの外径、内径、長さはそれぞれ6-12 nm、2.5-5 nm、1-9 μmでした。超音波処理後、得られた均質コロイド懸濁液を滅菌し使用しました。

その他の炭素ナノ粒子は南京XFNANO材料技術有限公司から入手しました。単層カーボンナノチューブ（SWCNT、XFS22；純度＞95%、直径1-2 nm、長さ5-30 μm、比表面積＞1075 m²/g）、グラフェン（XF001W；純度～99%、直径0.5-5 μm、厚さ～0.8 nm、単層比～80%、BET比表面積500-1000 m²/g；電気抵抗率≦0.30 Ω・cm）、活性炭（AC、XFP06；純度＞95%、粒子サイズ5±1 μm、細孔体積1-1.2 cm³/g、細孔径2.0-2.2 nm、比表面積～1500-1700 m²/g）。

また、ナトリウムニトロプルシド（SNP）をNO放出化合物として使用しました[30,31,32,33]。2-(4-カルボキシフェニル)-4,4,5,5-テトラメチルイミダゾリン-1-オキシル-3-オキシドカリウム塩（cPTIO）をNOスカベンジャーとして見なしました[51,52,53,54]。タングステート（Tg；NR阻害剤[28, 33, 37, 55,56,57]）とN^G-ニトロ-L-アルギニンメチルエステル塩酸塩（NAME；哺乳類NOS様酵素阻害剤[25, 33, 36,37,38,39]）も適用しました。本研究では、上記化学薬品の濃度は予備実験で決定し、有意な応答が観察された条件としました。

植物材料、生育条件、側根形成の測定

トマト（Solanum lycopersicum L.）種子「江蘇14」は江蘇省農業研究所（中国江蘇省南京市）から提供されました。同サイズの選抜種子を蒸留水中で25±1℃、暗条件下で3日間発芽させました。子根長2-3 mmの同一実生を選抜し、指定濃度のMWCNT、200 nM 1-ナフチル酢酸（NAA；よく知られたオーキシン）、0.1 mM SNP、0.2 mM cPTIO、20 μMタングステート（Tg）、0.2 mM NAME、および5 mg/mL単層カーボンナノチューブ（SWCNT）、グラフェン、活性炭（AC）などの他の炭素ナノ粒子を単独または組み合わせで含む6 mL処理液に移植し、指定時間培養しました。実生は光照射インキュベーター（25±1℃）で光強度200 μmol m⁻² s⁻¹、14/10時間（明/暗）光周期で生育させました。

処理後、写真を撮影し、出現側根（>1 mm）の本数と長さをImage Jソフトウェア（https://rsb.info.nih.gov/ij/）[39, 58]で測定しました。先行記載通り、側根誘導可能セグメントのみを後続解析に用いました。

透過型電子顕微鏡によるMWCNT分布のイメージング

トマト実生根内のMWCNT分布を透過型電子顕微鏡（TEM；JEOL、JEM-200CX、東京、日本）で特性評価しました。TEM解析用サンプル調製は先行プロトコル[59]に従いました。

レーザー走査共焦点顕微鏡による内因性NOイメージング

NOイメージングは、かなり特異的なNO蛍光プローブ4-アミノ-5-メチルアミノ-2′,7′-ジフルオロフルオレセインジアセテート（DAF-FM DA）を用いて実施しました。プローブを十分洗浄後、ツァイスLSM 710共焦点顕微鏡（Carl Zeiss、Oberkochen、Germany、励起488 nm、NO解析用放出500-530 nm）で画像取得しました。実験では、処理ごとに20個体をランダム選択し測定しました。写真は同一結果の代表例です。

グリース試薬法によるNO含量測定

先行記載法[50]に従い、グリース試薬法でNO含量を測定しました。重要なことに、植物内の濃縮硝酸塩と亜硝酸塩による干渉を回避するため、同一サンプルを200 μM cPTIO（NOスカベンジャー）で30分間予備インキュベートしたものをブランクサンプルと見なしました。グリース試薬添加後30分で540 nmで吸光度を記録し、NaNO₂標準曲線と比較してNO含量を決定しました。

電子スピン共鳴（EPR）によるNO測定

先行法[39, 55, 60]に従い、電子スピン共鳴（EPR）によるNOレベル測定を実施しました。有機溶媒層を用いて、以下の条件でブルカーA300分光計（Bruker Instrument、Karlsruhe、Germany）でNOを測定しました：室温；マイクロ波周波数9.85 GHz；マイクロ波出力63.49 mW；変調周波数100.00 kHz。

硝酸還元酵素（NR）活性測定

NR活性を先行法[57]に従い、540 nmで分光光度測定しました。生成亜硝酸塩を、3 M HCl中1%（w/v）スルファニルアミド1 mLと0.02%（v/v）N-(1-ナフチル)-エチレンジアミン1 mL添加後、540 nmで分光光度測定しました。

統計解析

指示がある場合、結果は3回独立実験、各3生物学的反復の平均値±SEで表しました。統計解析はSPSS Statistics 17.0ソフトウェアで実施しました。統計解析にはダンカン多重検定（p＜0.05）を適切として選択しました。

結果

MWCNTは根細胞内に取り込まれるだけでなく、側根形成を促進する

LR形成は根系構造の主要決定因子です。MWCNTのLR形成への影響を調査するため、3日齢トマト実生をMWCNT濃度範囲（0.05、0.5、5、50 mg/mL）で3日間インキュベートしました。1-ナフチル酢酸（NAA）投与を陽性対照としました。本実験では、LR本数と長さの両方をLR形成の2パラメータとして測定しました。図1に示すように、対照サンプルと比較して、外因性MWCNTが概ね用量依存的に側根形成を有意に誘導し、5と50 mg/mLで最大効果を示しました。200 nM NAA投与時にも類似の誘導応答が観察されました。MWCNTコストとLR形成誘導応答を考慮し、以降の実験では5 mg/mL MWCNTを適用しました。

MWCNT誘導トマト側根形成は概ね用量依存的。3日齢トマト実生を200 nM NAAと指定濃度のMWCNTでそれぞれ処理。3日処理後、出現側根（>1 mm）の本数と長さを実生あたり測定。3生物学的反復で30（10×3）植物、実験は3回実施。データは平均値±SE。各実験セット内で同じ文字のバーはp＜0.05水準でダンカン多重検定により有意差なし

MWCNTのLR形成誘導における特異的機能を検証するため、MWCNTの他の同素体も同様の誘導効果を持つかさらに調査しました。図2aに示すように、これらすべての炭素ナノ材料はシュート成長に毒性効果を示しました（データ未表示）。興味深いことに、同一濃度（5 mg/mL）のMWCNT、単層カーボンナノチューブ（SWCNT）、グラフェン、活性炭の適用が、化学物質フリー対照植物と比較して、LR本数と長さの増加を差異的に引き起こしました（図2b）。これらの化学物質の中で、MWCNTインキュベートトマト実生で最大誘導応答が発見されました。

異なる炭素ナノ粒子応答による側根形成変化。3日齢トマト実生を蒸留水（Con）、5 mg/mL MWCNT、単層カーボンナノチューブ（SWCNT）、グラフェン、活性炭（AC）でそれぞれ3日間処理。a 代表写真を撮影。b 出現側根（>1 mm）の本数と長さを実生あたり測定。スケールバー=50 mm。3生物学的反復で30（10×3）植物、実験3回実施。データは平均値±SE。各実験セット内で同じ文字のバーはp＜0.05水準でダンカン多重検定により有意差なし

透過型電子顕微鏡（TEM）により、MWCNT分布を容易に評価できます。図3に示す結果では、外因性適用されたMWCNTがトマト実生に吸収され、MWCNT分布が根細胞内で見つかりました。この結果は、実生根がMWCNT含有液体溶液で直接培養されているため理解できます。

トマト根内MWCNT分布。蒸留水（Con；a）または5 mg/mL MWCNT（b）で1日間処理した3日齢トマト実生のTEM画像。赤矢印は細胞壁、白矢印はMWCNTを示す

MWCNT誘導NO合成とその後の側根形成は、NOスカベンジャーcPTIOに感受性

NOがMWCNT誘導側根形成にも関与するか調査するため、NO放出化合物とスカベンジャーを用いて内因性NOレベルを操作し、MWCNT誘導LR形成におけるNOの機能を評価しました。先行結果[31]と同様に、ナトリウムニトロプルシド（SNP）投与が側根形成誘導をもたらし、SNPとMWCNTを同時に適用すると加算的応答が観察されました（図4）。2-(4-カルボキシフェニル)-4,4,5,5-テトラメチルイミダゾリン-1-オキシル-3-オキシドカリウム塩（cPTIO；NOスカベンジャー）添加時、MWCNTによる側根形成促進応答が有意に損なわれました。単独でcPTIOは化学物質フリー対照と比較して側根発育を阻害し、根器官形成における内因性NOの重要な役割を示しています。

MWCNT誘導側根形成は内因性NO除去によりcPTIO（スカベンジャー）で感受性。3日齢トマト実生を蒸留水、5 mg/mL MWCNT、0.1 mM SNP、0.2 mM cPTIO、単独または組み合わせで3日間処理。その後、出現側根（>1 mm）の本数と長さを実生あたり測定。3生物学的反復で30（10×3）植物、実験3回実施。データは平均値±SE。各実験セット内で同じ文字のバーはp＜0.05水準でダンカン多重検定により有意差なし

内因性NOのMWCNT応答における重要な役割をさらに評価するため、グリース試薬法でNO生成のタイムコースをまずin vivoで検出しました。上記測定では、同一濾液をcPTIOで30分間前処理したものを正確な結果のためのブランクと見なしました。MWCNT処理後24時間までトマト実生根内因性NO生成が劇的に増加し、その後初期レベルに回復することが観察されました（48時間；図5a）。MWCNTにより24時間で誘発された内因性NO最大レベルは、NOスカベンジャーcPTIOにより明確に消失させられ、NOの特異的役割を示唆しました。

MWCNT誘導NO生成はcPTIO（NOスカベンジャー）により阻害。3日齢トマト実生を蒸留水と5 mg/mL MWCNTを0.2 mM cPTIOあり/なしで処理。a NR活性変化（左）とグリース試薬法によるNO生成（右）。b 24時間処理後、LSCM（左）とEPR（右）でNOシグナル解析。スケールバー=0.1 mm。データは平均値±SE。同じ文字のバーはp＜0.05水準でデュカン多重検定により有意差なし

上記結果を確認するため、LSCMとESRの両方を採用しました。まず、細胞透過性でかなりNO特異的な蛍光プローブDAF-FM DAでNOを標識し、LSCMでイメージングすることで、トマト実生根内因性NOレベル変化をモニターしました。先行結果（図5a）と同様に、cPTIO存在下でMWCNT誘発DAF-FM依存性蛍光強度増加が大幅に消失しました（図5b）。これらの結果は、DAF-FM誘発蛍光がトマト実生根内因性NOレベルに関連することを示唆します。

MWCNT誘導NO生成はEPR分光法で確認されました。予想通り、MWCNTで24時間処理した実生根はNO複合体の典型的な超微細構造三重項を示しました。しかし、cPTIO添加で上記シグナルが消失し、MWCNT曝露が強力なNO生成をもたらすことを示しました（図5b）。総じて、これらのデータはNO合成がトマト実生におけるMWCNT誘発側根形成に必要である可能性を示唆しています。

NRがMWCNT誘導NO生成とその後の側根形成を担う可能性

NRと哺乳類型NOSは植物におけるNO合成に関連する2つの主要酵素であるため、タングステート（NR阻害剤）とNAME（哺乳類NOS阻害剤）を後続実験で適用しました。ここでは、タングステート処理がMWCNT処理トマト実生根の側根形成促進を実質的に抑制しました（図6）。比較的に、MWCNT誘導側根形成はNAME添加では強く阻害されず、哺乳類型NOSがMWCNT誘発NO生成の標的NO合成酵素ではない可能性を示唆します。タングステートまたはNAMEを単独適用しても、トマト実生で側根形成のわずかな非有意減少のみ観察されました。

MWCNTと2つのNO合成阻害剤応答による側根形成変化。3日齢トマト実生を5 mg/mL MWCNT、20 μMタングステート（Tg）、0.2 mM NAME、単独または組み合わせで3日間処理。その後、出現側根（>1 mm）の本数と長さを実生あたり測定。3生物学的反復で30（10×3）植物、実験3回実施。データは平均値±SE。各実験セット内で同じ文字のバーはp＜0.05水準でダンカン多重検定により有意差なし

NRのMWCNT誘導側根形成における役割を、適用MWCNTあり/なしでのNO生成モニタリングによりさらに検証しました。内因性NO生成変化（図5a）と比較して、NR活性タイムコース解析も類似傾向を示し（図7a）、MWCNT処理後24時間でピークに達しました。これらの結果は、MWCNT誘導NO生成増加が主にNR活性増強によるものである可能性を示唆します。一貫して、タングステートによるNR依存的NO生成阻害は、グリース試薬法（図7b）、LSCM、EPR（補足ファイル1：図S1）で確認されました。

MWCNT誘導NO生成はタングステート（NR阻害剤）により阻害。3日齢トマト実生を蒸留水と5 mg/mL MWCNTを20 μMタングステート（Tg）あり/なしで処理。グリース試薬法によるNR活性（a）とNO生成（b）変化。データは平均値±SE。同じ文字のバーはp＜0.05水準でデュカン多重検定により有意差なし

考察

植物毒性はナノ粒子の潜在的環境影響理解において重要な考慮事項です[4, 7, 61,62,63]。豊富な証拠が、MWCNTが酸化損傷誘発、種子発芽抑制、根成長発育阻害など、植物に毒性を示すことを明らかにしています[11, 63, 64]。しかし、SIMRの表現型として、側根形成による根分枝は根系の様々な環境手がかりへの適応性の重要な構成要素です[17]。本研究では、生物学的、薬理学的、生化学的解析を統合し、実験条件下で少なくとも部分的にNR依存的NO生成がMWCNT誘導側根形成に関与することを示しました。また、MWCNT刺激根器官形成におけるNO機能は、植物発育プロセスとストレス適応に関与するこのセカンドメッセンジャーの中心的役割を強調しました[29,30,31,32,33, 37, 38]。

まず、5 mg/mL MWCNT（外径6-12 nm）が根組織内に侵入することを確認しました（図3）。その後、トマト側根形成誘導が観察されました（図1）、NAAとSNP（図4）の誘導役割を模倣し、よく知られたNO放出化合物です[30, 31]。樹脂樹[41]、レタス[42]、シロイヌナズナ[43]でMWCNTチャレンジ（外径6-13 nm、約9.5 nm、30-40 nm）時に類似誘導応答が発見されました。例えば、プリスティンMWCNT（p-MWCNT）またはカルボキシル官能基化MWCNT（c-MWCNT）（平均直径9.5 nm）適用がレタス実生側根発育促進をもたらしました[42]。対照的に、大豆植物ではMWCNT（外径20-70 nm[40]）曝露時に主根および側根形成抑制が同時に見出されました。MWCNT外径データ（表1）と比較すると、MWCNTの側根形成効果は直径によって変化し、低直径で促進、高直径で抑制を示すと推測されました。確かに、関連メカニズムは慎重に調査すべきです。類似現象は植物塩耐性[50]で確認されました。上記結果と合わせ、ナノ材料機能は植物種によって異なり、逆もまた然り、異なるタイプのナノ材料が様々な生物学的効果を引き起こす可能性が推測されました。しかし、MWCNT異なる用量[48]や植物生育条件など他の影響因子も容易には除外できません。

同一濃度のSWCNT、グラフェン、ACなど他のナノ材料と比較して、側根形成最大誘導とシュート成長への毒性効果がMWCNTで観察されました（図2）。これらはMWCNTの特殊な物理的特性、すなわち高電気伝導性、大きな比表面積、高アスペクト比、顕著な熱安定性を持つナノ材料の一種であることに関連する可能性があります[65]。ナノ材料毒性効果はキュウリ、キャベツ、ニンジン、タマネギなどで広く報告されています[66, 67]。

豊富な証拠が、シグナル分子として作用するNOが、環境適応から発育まで幅広い植物プロセスを制御でき、後者には種子発芽と根器官形成が含まれることを示しています[29, 68,69,70,71,72,73]。その後の実験で、NOがMWCNT誘導側根形成に関与する可能性が明らかになりました。植物細胞内NO生成イメージング法がいくつか適用されていますが、感度不足やNO非依存分子による干渉などの欠点が各法に存在する可能性があります[74]。したがって、グリース試薬法、LSCM、EPRの3つのNOイメージングおよび測定法と、NOスカベンジャーcPTIO適用を実験条件下で適用しました。3つの方法により、MWCNTによりトマト実生で誘発された内因性NO生成増加がcPTIOにより消失することを観察しました（図5）、NOスカベンジャー[30,31,32]。重要なことに、このプロセスはMWCNT誘導側根発育生物学的応答と相関し、cPTIO同時適用で著しく阻害されました（図4）。

これらの応答と外因性適用MWCNT誘導NOの潜在的源のさらなる評価により、NO生成とその後の側根形成がNR活性に帰属できることが明らかになりました。植物ではNO生成は主にNRと哺乳類NOS様タンパク質から生成されます[28]。しかし、植物NOS遺伝子は未同定[35, 75, 76]ですが、哺乳類NOS酵素阻害剤使用実験でL-アルギニン依存経路のNO生成証拠が一部得られています[36, 76]。NRは植物におけるNOの最も重要な源と確認されています[28]。先行研究では、NR依存的NO生成が硝酸関連シグナルとして根系構造制御に機能することが示されました[32, 33]。また、NR依存的NO生成は寒順化[38]、塩耐性[50]、アブシシン酸誘導気孔閉鎖[77]と密接に関連していました。我々の結果はさらに、タングステート（NR阻害剤）がMWCNT誘導側根形成、特に側根長を明確に損なうことを明らかにしました（図6）。対照的に、L-NAME（哺乳類NOS阻害剤）使用時は側根長のわずかな減少のみで、側根本数に有意差は観察されませんでした。一貫して、生化学アッセイでNR活性がMWCNTにより明確に増加することを示しました（図7a）、NO生成変化と並行（図5a）。上記応答はタングステートで完全に阻害されました（図7a、補足ファイル1：図S1）。したがって、MWCNT誘導内因性NO生成増加は主にNR経路に帰属すると推論しました。確かに、さらなる遺伝的証拠を調査すべきです。

結論

要約すると、MWCNT誘導NO生成がNRを介してトマト側根形成に必要である証拠を提供し、これは図8に要約されています。重要なことに、上記知見は植物におけるMWCNT機能の複雑な分子メカニズムへの洞察を提供します。

MWCNT誘導トマト側根形成の提案メカニズム：主にNR依存的NO生成を介する。哺乳類NOS様酵素の役割は予備的に除外

データおよび資料の入手可能性

すべてのデータは制限なく完全に入手可能です。

略語

CO:

一酸化炭素

cPTIO:

2-(4-カルボキシフェニル)-4,4,5,5-テトラメチルイミダゾリン-1-オキシル-3-オキシドカリウム塩

DAF-FM DA:

4-アミノ-5-メチルアミノ-2′,7′-ジフルオロフルオレセインジアセテート

EPR:

電子スピン共鳴

GO:

グラフェン酸化物

H₂:

水素ガス

H₂O₂:

過酸化水素

L-NAME:

N^G-ニトロ-L-アルギニンメチルエステル

LR:

側根

LSCM:

レーザー走査共焦点顕微鏡

MWCNT:

マルチウォールカーボンナノチューブ

NAA:

1-ナフチル酢酸

NO:

一酸化窒素

NOS:

一酸化窒素シンターゼ

NR:

硝酸還元酵素

ROS:

活性酸素種

SIMR:

ストレス誘導形態形成応答

SNP:

ナトリウムニトロプルシド

SWCNT:

単層カーボンナノチューブ

TEM:

透過型電子顕微鏡

Tg:

タングステート