最適化された水酸基を持つ水溶性フラーレノールが二光子光力学療法で感染性微生物を不活性化

概要

高い一重項酸素量子収率を示し、効率的に反応性酸素種（ROS）を生成する水溶性フラーレノール[C₆₀(OH)₄₆]を調製することに成功しました。さらに、露出した水酸基の組成が高い水溶性C₆₀(OH)₄₆は、組成が低いものと比較して優れた二光子安定性と特性を示しました。したがって、調製されたフラーレノールは効果的な二光子光感作剤となり得ます。水溶性C₆₀(OH)₄₆は好ましい二光子特性を持ちました。二光子光力学療法において、水溶性C₆₀(OH)₄₆は、800回走査、光励起波長760 nm、超低エネルギーレベル211.2 nJ/pixelでEscherichia coliに対して実質的な抗菌活性を示しました。

はじめに

過去数十年間で様々な光感作剤（PS）分子が合成されてきました[1]。しかし、既存PSの臨床応用にはいくつかの問題があります。ほとんどのPS分子は疎水性で水性媒体中で容易に凝集し、量子収率（QY）を低下させます[2]。また、凝集したPSは静脈内投与が困難です。損傷組織へのPS分子の選択的蓄積も、健康な細胞へのダメージを防ぐために必要です。これらの問題により、効果的なPSキャリアの開発は光力学療法（PDT）の主要な課題となっています。したがって、ナノ粒子をPSキャリアとして利用する関心が高まっています。

ナノバイオテクノロジーの進展により、炭素原子のみで構成される新しいクラスのナノ構造体、すなわちフラーレンC₆₀の医用応用への関心が刺激されています[3-11]。フラーレンC₆₀は球状分子（直径0.72 nm）で、無毒かつ独自の物理化学的特性を持ちます。疎水性C₆₀分子の小さなサイズは生物学的分子との立体的適合性をもたらし、膜の疎水性領域への統合を促進します[12,13]。分子軌道の拡張π共役系により、フラーレンC₆₀は紫外-可視（UV-vis）光を吸収し、ほぼ100%の一重項酸素QY（Φ_Δ）で反応性酸素種（ROS）を生成できます。さらに、フラーレンC₆₀の物理化学的特性により、ROSを生成しPDTの光感作剤として機能できます。フラーレンはプロオキシダント効果も誘導する可能性があり、これは使用するフラーレン、調査対象の細胞タイプ、実験セットアップによって決まる可能性があります[14-17]。C₆₀は極性溶媒への溶解度が極めて低く、医療応用を大きく制限しています。しかし、二重結合の存在により、C₆₀は化学基で容易に修飾して水溶性を高めることができます。したがって、水溶性C₆₀誘導体は、神経保護、薬物・遺伝子送達、光感作、バイオセンシングなど医療応用の機会が増えています。

多光子レーザー顕微鏡（二光子レーザー顕微鏡としても知られる）は、局所的な「非線形」励起を用いて、薄いラスター走査面内のみで蛍光を励起します。二光子レーザー顕微鏡は様々なイメージング研究で使用されてきました[18]。通常、近赤外（NIR）レーザー励起と組み合わせ、バイオイメージングのための固有の最大組織透過性を活用します。これはNIRが散乱が少なく、低エネルギー吸収、最適な照射透過、試料の光漂白低減という利点を持つためです。二光子レーザー顕微鏡とNIRレーザー励起の組み合わせは、厚い組織やより深い生物学的試料における蛍光顕微鏡の好ましい技術となり[19,20]、他の光励起療法にも広く応用されています[21,22]。さらに、超低エネルギーと短い光励起により、二光子レーザー顕微鏡はPDTを実施する代替アプローチと見なされています[23]。一部のPSは毒性を持ちますが[24,25]、高いΦ_Δを持つものがPDT実施に優先されます。高いΦ_Δ値は、二光子技術を用いて光特性の分子活性を評価し、非線形顕微鏡研究を効率的に行う際に特に望ましいです。これは、試料に吸収されるエネルギーと入力エネルギーフラックスの比率が高く、試料への光ダメージを最小限に抑えるためです[26]。しかし、文献には二光子特性を持つ材料をPDTに用いた研究は含まれていません。この研究ギャップを埋めるため、本研究では強い電子供与能と大きなπ共役系を持つ水溶性ヒドロキシル化フラーレノールを適用し、電荷移動効率を高めて二光子特性を増強しました。具体的には、水溶性ヒドロキシル化C₆₀(OH)₄₆を導出し、超低エネルギーフェムト秒レーザー照射と二光子励起（TPE；励起波長760 nm）下でわずか800回走査のみで、効果的な微生物除去のための二光子PSとして適用しました。超低エネルギーフェムト秒レーザー照射では、エネルギーは211.2 nJ/pixel、パワーは2.112 mWでした（レーザーシステムのx-y焦点とz軸分解能はそれぞれ約0.37538 μmと0.90159 μm；詳細は「材料と方法」セクションと図1a参照）。走査プロセスでは、総有効露光時間は約3.2621秒、走査レートは4.0776 ms/走査、走査面積は200×200 μm²でした（「材料と方法」セクションで計算詳細参照）。水溶性ヒドロキシル化C₆₀(OH)₄₆は、Escherichia coli（E. coli、グラム陰性菌株）をほぼ100%除去しました。さらに、TPE下では水溶性C₆₀(OH)₄₆の水酸基組成が高いものは低いものと比較して優れた二光子光特性を示しました。したがって、導出された水溶性C₆₀(OH)₄₆は、悪性微生物を除去する同時PDTへの相当な潜在能力を持つと考えられます。

材料と方法

水溶性フラーレノールC₆₀(OH)₂₁とC₆₀(OH)₄₆の調製と特性評価[27]

生フラーレンを市販品（Sigma-Aldrich、セントルイス、MO、USA）から入手し、C₆₀(OH)₁₂前駆体を従来法で調製しました。まず、出発物質0.5–1.0 gのC₆₀(OH)₁₂に30%過酸化水素溶液（100 mL；Sigma-Aldrich）を添加し、空気中で60℃で激しく撹拌しました。冷却後、2-プロパノール、ジエチルエーテル、ヘキサンの混合溶媒（各100–200 mL；Sigma-Aldrich）を溶液に添加し、遠心分離と上澄み除去を行いました。残留固形分をジエチルエーテル200 mLで遠心分離と上澄み除去により2回洗浄しました。最終的に、残留物を室温で一晩真空乾燥することで、水溶性C₆₀(OH)₂₁とC₆₀(OH)₄₆の最終生成物を得ました。最終生成物の重量は熱重量分析で較正しました。最終生成物の形態を高分解能透過型電子顕微鏡（HR-TEM、JEOL 3010、昭島、東京、日本）で観察し、分解能はC₆₀(OH)₂₁とC₆₀(OH)₄₆でそれぞれ約1.11±0.03 nmと1.13±0.04 nmでした。動的光散乱（DLS、Malvern Nano-ZS90、ウスタシャー、ウェストミッドランズ、UK）でも材料サイズを決定しました。調製材料の露出官能基をフーリエ変換赤外（FTIR）分光法（RX1、PerkinElmer、ウォルサム、MA、USA）で最初に検討しました。材料のUV-vis分光法を分光光度計（U-4100、日立、千代田区、東京、日本）で実施しました。フラーレノールの表面化学をX線光電子分光法（XPS、PHI 5000分光計（VersaProbe、シャナッセン、MN、USA））で検討しました。フラーレノールの分子量をフィールド脱離（FD）質量分析計（AccuTOF、GCx-plus、JEOL、昭島、東京、日本）で決定し、水酸基の数がそれぞれ21と46であることを確認しました。

細菌培養[28]

自前の研究室由来のE. coliを、LB寒天培地（1リットルあたり：トリプトン10 g、酵母エキス5 g、塩化ナトリウム8 g、寒天15 g、pH 7.5に調整）（Sigma-Aldrich）で37℃で培養しました。

コロニー形成単位（CFU）計数法による生体適合性アッセイ[28]

E. coli（OD₆₀₀ ~ 0.05）に材料（0–9 μg/mL）を添加し、37℃で3時間インキュベート（追加ファイル1：図S1）。インキュベート後、混合物を遠心分離し、細菌ペレットを希釈（OD₆₀₀ ~ 0.05）。希釈倍率10⁻⁵–10⁻⁸でインキュベートした細菌を寒天平板に塗布。平板をインキュベーター（37℃）で一晩放置。生存菌数を決定し、インキュベーション後のCFU/mLに対応するパーセンテージ（%）で表現。データは平均±SD（n=6）。

ψ_Δ測定[29,30]

先行研究に従い、ψ_Δを取得できます。ψ_Δ測定は355 nmでD₂O中で実施し、meso-テトラ(4-スルホナトフェニル)ポルフィン二塩酸塩（TSPP；Sigma-Aldrich）を基準（ψ_Δ = 0.64）としました。

蛍光QY測定[31,32]

コントラスト剤の相対光ルミネッセンス（PL）QYは通常、放出光子数と吸収光子数の比で与えられます：

$$ \mathrm{QY}={\mathrm{QY}}_{\mathrm{ref}}\ \left({\eta}^2/{\eta_{\mathrm{ref}}}^2\right)\left(I/A\right)\left({A}_{\mathrm{ref}}/{I}_{\mathrm{ref}}\right) $$ (1)

ここでQY_ref = 0.28はジメチルスルホキシド（DMSO；Sigma-Aldrich）に溶解したCy5.5のQY、ηはddH₂Oの屈折率=1.33（η_ref of DMSO = 1.48）、Iは積分蛍光強度、Aは励起波長での吸光度です。一光子励起（OPE）またはTPEで同じQYが得られます。

二光子吸収（TPA）と二光子ルミネッセンス（TPL）測定用フェムト秒レーザー光学系[23,28,33-38]

自作のフェムト秒チタン-サファイア（ti-sa）レーザー光学系（繰り返し周波数80 MHz；Tsunami、Spectra-Physics、サンタクララ、CA、USA）を先行研究に従って使用しました。

TPA測定

ガルバノメータースキャナ速度2 m/msで、励起スペクトルを720–820 nm、励起パワー2.8 mWで測定しました（これは対物レンズ前のパワー；対物レンズ後（または試料上）のパワーは0.9856 mWまたは98.56 nJ/pixel）。したがって、フラーレノールの励起波長関数としての相対TPAスペクトルを測定しました。

TPLスペクトル測定

材料をフェムト秒レーザーからのTPEに曝露しました。励起波長760 nm、走査面積200×200 μm²、周波数10 kHz、露光時間1.638秒/(走査、ピクセル)=100 μs、128×128ピクセル/走査、ピクセル面積1562.5×1562.5 nm²。焦点スポット面積はπd²/4で計算、d=0.61λ/数値開口数（NA）はビームウェストの半値全幅。例えば、760 nm励起とNA 1.3の×40油浸対物レンズでは、d=0.61×800 nm/1.3=375.38 nm=0.37538 μm、z軸分解能は0.90159 μmと測定されました。760 nm励起での個々ナノ材料の走査あたり露光時間は（焦点スポット面積/ピクセル面積）×100=4.0776 ms、総露光時間t=4.0776 ms×走査回数。×40油浸対物レンズ（NA 1.3）で信号を収集し、分光光度計の検出範囲は300–695 nmでした。

また、試料上で使用されるレーザーパワー（mWまたはnJ/pixel）の計算は以下の通りです。×40油浸対物レンズ（NA 1.3）での760 nm波長の透過率はこの光学系で約88%、レーザーパワーは出力から対物レンズまで元の出力パワーの40%のみが到達します。したがって、対物レンズ後（試料上）の計算エネルギーはP_output(mW)×40%×88%=0.352×P_output(mW)。例えばP_output=2.8 mWの場合、対物レンズ後（試料上）の計算エネルギーは2.8 mW×40%×88%=0.9856 mW。10 kHzの走査レート（各パルス0.1 ms/pixel滞在）では、試料上の計算エネルギー（J/pixel）はP_output(mW)×40%×88%×0.1 ms=0.0352×P_output(J/pixel)。例えばP_output=2.8 mWの場合、試料上のエネルギー=2.8 mW×40%×88%×0.1 ms=0.09856 μJ/pixel=98.56 nJ/pixel。対物レンズ後のパワー（試料上）を本稿全体で使用し、明記しました。

TPE絶対クロスセクション測定[24,36-48]

TPEの絶対クロスセクションを、フェムト秒レーザー光学系によるルミネッセンス信号測定により先行研究に従って測定しました。フルオレセインとローダミンB（Sigma-Aldrich）のTPLを検証する必要がありました。結果は図1bに示し、励起パワー範囲704 nJ/pixel（7.04 mW）から2816 nJ/pixel（28.16 mW）で放出強度の依存性を測定して得られました。励起パワーを増加させてTPEからのルミネッセンスを決定するため、フルオレセインで2.03、ローダミンBで2.02の指数を持つ二次依存性を測定しました。先行研究によれば、760 nm励起でのフルオレセインとローダミンBのTPE作用クロスセクションはそれぞれ36.4と68.0 GM（1 GM=10⁻⁵⁰ cm⁴ s photon⁻¹）です。また、Prof. Chris Xu（コーネル大学、NY、USA）提供の無料ウェブサイトhttps://www.drbio.cornell.edu/cross_sections.htmlも参照しました。本研究ではフルオレセインとローダミンBのTPE作用クロスセクションをそれぞれ36.5と66.1 GMと計算し、Prof. Xuの研究室の値と5%未満の誤差であることを示しました。本研究ではローダミンBを標準基準としてクロスセクション決定に用い、水溶性C₆₀(OH)₂₁とC₆₀(OH)₄₆フラーレノールのTPE絶対クロスセクションをそれぞれ約1230.51 GMと1037.21 GMと算出しました。TPE絶対クロスセクション算出の測定パラメータを表1に示します。材料の二光子特性と二光子光力学能にバッチ間変動は観察されませんでした。

蛍光寿命イメージング顕微鏡（FLIM）用フェムト秒レーザー光学系[39,45]

自作フェムト秒ti-saレーザー光学系（繰り返し周波数80 MHz；Tsunami、Spectra-Physics、サンタクララ、CA、USA）を先行研究に従って使用しました。寿命データとパラメータは、TPE下（励起760 nm）で放出をモニタリングしながら三重指数方程式フィッティングで生成しました。

放射的・非放射的崩壊率の計算[46]

PL QYと寿命は、多様な環境における蛍光色素の放出特性を調査する際の主要パラメータです。QY（Q）は以下のように表現できます：

$$ Q=\frac{\varGamma }{\varGamma +k} $$ (2)

ここでΓは放射的崩壊率、kは非放射的崩壊率です。蛍光寿命は通常、励起状態の電子が基底状態に崩壊するのに要する平均時間と定義されます。TPL寿命τも崩壊率に関連し、以下のように記述されます：

$$ \tau =\frac{1}{\varGamma +k} $$ (3)

式(2)と(3)に従い、放射的・非放射的崩壊率を計算できます。

光子吸収により、蛍光分子（フロロフォア）の弱く結合した電子の1つがより高いエネルギー準位に促進されます。フロロフォアは励起状態A*になります。この状態はメタステーブルであるため、フロロフォアは安定な基底状態Aに戻ります。これは放射的に蛍光光子hνを放出して、または非放射的に励起状態エネルギーを熱として散逸させて起こります：

$$ A\ast \rightarrow A+ h\nu $$ $$ A\ast \rightarrow A+\mathrm{heat} $$

励起状態の消失は、利用可能な非励起経路に依存します。蛍光は、第一励起単重項状態S₁の最低振動エネルギー準位から電子基底状態S₀への放射的非活性化です。単重項状態は、スピンフリップなしで弱く結合した電子によって占有されるエネルギー準位です。吸収と放出プロセスは、アレクサンダー・ヤブロンスキーに因んで名付けられたエネルギー準位図（ヤブロンスキー図）で説明されます。

蛍光寿命τは、励起後にフロロフォアが電子励起状態S₁に留まる平均時間です。τは、すべての励起状態消失プロセスのレートパラメータの和の逆数として定義されます：式(3)、ここで非放射的レート定数kは内部変換レート定数k_icと三重項状態への系間交差レート定数k_iscの和で、k=k_ic+k_iscです。蛍光放出は常にS₁の最低振動レベルから起こり、これはカシャの法則として知られ、フロロフォアは励起経路の記憶を持たないことを示します。例えば、OPEとTPEで同じ蛍光スペクトル、QY、寿命が得られます。

レーザー曝露後の細菌生存率決定[28]

CFU計数法

細菌（OD₆₀₀ ~ 0.05）に材料（3または6 μg/mL）を添加し、37℃で暗所にて3時間インキュベート。インキュベート後、混合物を遠心分離し、細菌ペレットを希釈（OD₆₀₀ ~ 0.05）して、TPEパワー211.2 nJ/pixel、800回走査（総有効露光時間約3.2621秒；励起760 nm）で曝露。その後、希釈倍率10⁻⁵–10⁻⁸でインキュベートした細菌を寒天平板に塗布。平板をインキュベーター（37℃）で一晩放置。生存菌数を決定し、インキュベーション後のCFU/mLに対応するパーセンテージ（%）で表現。データは平均±SD（n=6）。

LIVE/DEADキット

細菌（OD₆₀₀ ~ 0.05）に材料（3または6 μg/mL）を添加し、37℃で暗所にて3時間インキュベート。インキュベート後、混合物を遠心分離し、細菌ペレットを希釈（OD₆₀₀ ~ 0.05）して、TPEパワー211.2 nJ/pixel、800回走査（総有効露光時間約3.2621秒；励起760 nm）で曝露。その後、LIVE（SYTO 9、緑色蛍光）/DEAD（プロピジウムヨウ化物、PI、赤色蛍光）キット（Thermo Fisher Scientific、ウォルサム、MA、USA）の指示に従ってペレットを染色。細菌の生存率を抗菌試験用に定量化し、ナノ材料処理菌のほぼすべてが処理後に死滅することを示しました。同様の生存率をCFU計数法で定量化し、PDTにおける材料の効率的な抗菌効果を決定。データは平均±SD（n=6）で提示。

ROS検出[23,29,34,35,49-55]

一重項酸素（¹O₂）

(a) 材料（3または6 μg/mL）を細菌（OD₆₀₀ ~ 0.05）で処理し、37℃で暗所にて3時間インキュベート。その後、混合物をTPE光励起（211.2 nJ/pixel、800回走査；励起760 nm）に曝露し、最後に一重項酸素センサーグリーン（SOSG）試薬（1 μM；Thermo Fisher Scientific）（励起/放出：488/525 nm）と混合。蛍光分光光度計で測定。ROS中和のため、混合物を30 ppmの抗酸化剤α-トコフェロール/メチルリノレート（Sigma-Aldrich）で暗所にて混合し、同じ処理でTPE光励起に曝露。(b) 材料（3または6 μg/mL）を細菌（OD₆₀₀ ~ 0.05）で処理し、37℃で暗所にて3時間インキュベート。その後、混合物をTPE光励起（211.2 nJ/pixel、800回走査；励起760 nm）に曝露し、最後にtrans-1-(2′-メトキシビニル)ピレン（t-MVP、Thermo Fisher Scientific）/0.10 M SDS（Sigma-Aldrich）（励起/放出：352/465 nm）10 μMと混合。ROS中和のため、混合物を30 ppmの抗酸化剤α-トコフェロール/メチルリノレート（Sigma-Aldrich）で暗所にて混合。t-MVPと¹O₂の反応でジオキセタン中間体が生成し、分解時に蛍光を発し1-ピレンカルボキシアルデヒドになります。さらに、この高選択的蛍光プローブはヒドロキシルラジカル、スーパーオキシド、過酸化水素など他の活性酸素種とは反応しません。蛍光分光光度計で測定。ROS中和は前述と同じ処理で実施。

スーパーオキシドラジカルアニオン（O₂^·−）

(a) 材料（3または6 μg/mL）を細菌（OD₆₀₀ ~ 0.05）で処理し、37℃で暗所にて3時間インキュベート。その後、混合物をTPE光励起（211.2 nJ/pixel、800回走査；励起760 nm）に曝露し、最後に2,3-ビス(2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム-5-カルボキシアニリド（XTT、0.45 mM；Sigma-Aldrich）と混合。この材料の目的はO₂^·−と相互作用しXTT-フォルマザンを生成し、強い吸収（波長470 nm）を生じさせること。UV-vis分光光度計でこの吸収をモニタリング。ROS中和のため、混合物を30 ppmの抗酸化剤α-トコフェロール/メチルリノレート（Sigma-Aldrich）で暗所にて混合し、同じ処理でTPE光励起に曝露。(b) 材料（3または6 μg/mL）を細菌（OD₆₀₀ ~ 0.05）で処理し、37℃で暗所にて3時間インキュベート。その後、混合物をTPE光励起（211.2 nJ/pixel、800回走査；励起760 nm）に曝露し、最後に50 mM重炭酸緩衝液（pH 8.60）とグルタチオン（γ-L-グルタミル-L-システイニル-グリシン、GSH、Sigma-Aldrich）/0.80 mM重炭酸緩衝液（O₂^·−検出用Ellmanアッセイ）と混合。その後、先行研究の手順に従って実験を実施。GSH損失（%）を試料と陰性対照の吸光度差を陰性対照の吸光度で割った値として計算。生成されたO₂^·−のシグナルを前述の計算で取得。データは平均±SD（n=6）。

取り込みアッセイ[35]

E. coli（OD₆₀₀ ~ 0.05）を3 μg/mL材料でインキュベート。3 μg/mL材料の吸光度をUV-vis分光法で記録（Abs、約203 nm）。材料をE. coli（OD₆₀₀ ~ 0.05）と37℃で1時間目から10時間目までそれぞれ混合し、遠心分離（1200 rpm）で過剰材料を除去し上清を保存して吸光度を測定。回収上清と元の材料の吸光度差を推定し、各時点での取り込み率を算出。データは平均±SD（n=6）。

統計解析[56]

統計的有意性は分散分析で評価。すべての処理でp値を統計学的有意とみなしました。

結果と考察

水溶性フラーレノールの特性評価

先行研究[27]に従って合成された水溶性C₆₀(OH)₄₆（フラーレノール）は、円形で単分散であることが確認されました。フラーレノールの平均側面サイズは、低倍率（図2a）とHR-TEM像（図2b）により約1.13±0.04 nmと決定されました。さらに、フラーレノールはフラーレノール{11̅00}格子縞のd-間隔に対応する良好な格子間隔とともに好ましい結晶性を示しました。しかし、これらの粒子はpH 7.0の水溶液中で水素結合を通じて凝集体を形成する可能性があります。形成された凝集体の平均サイズはDLS解析により約130 nmと明らかになりました。また、凝集体はpH 7.0水溶液、1×リン酸緩衝生理食塩水、培養液など異なる生理環境で3ヶ月間高い安定性を維持しました（追加ファイル1：表S1）。フラーレノールのUV-vis吸収スペクトルでは、約216 nmと309 nmに吸収ピークが観察され、これらはそれぞれ芳香族C=C結合のπ–π*遷移とC=Oショルダーのn–π*遷移に起因するとされました。フラーレノールのπ電子遷移は酸素を含んでいました（図2c）、これは水性分散系で典型的に観察されるもので、フラーレノールの存在を確認しました。FTIR、XPS、質量分析による追加特性評価で調製材料の特性を確認しました。FTIRで調製材料の露出官能基を分析。分析結果は以下の特徴的材料バンドを明らかにしました：約1109 cm⁻¹のC–O伸縮バンド（バンド1）、約1271 cm⁻¹のフェノール性C–OH伸縮バンド（バンド2）、約1422 cm⁻¹の第三級アルコール性C=O伸縮バンド（バンド3）、約1674 cm⁻¹のC=C伸縮バンド（バンド4）、約1721 cm⁻¹のC=O伸縮バンド（バンド5）、約3318 cm⁻¹のC–H分子間水素結合とカルボキシレートO–H伸縮バンド（バンド6）。さらに、CO₂干渉バンドも観察されました。これらのバンドは露出した水酸基とカルボニル基、芳香族C=C結合を明らかにしました（図2d）。XPSでフラーレノールの表面化学を検討。フラーレノールは一般に炭素原子を主に含みます。フラーレノールの脱畳み込みC(1s)スペクトルは、非酸素化環（C–C/C=C、286.1 eV）、C–O結合（286.9 eV）、C=O結合（288.0 eV）を示しました。さらに、O(1s)/C(1s)比は約35.8%でした（図2e）。フラーレノールの分子量もFD質量分析で決定（追加ファイル1：図S2）；水酸基（C–OH）の数が46であることを確認し、これは図2にまとめたフラーレノールの原子比と結合組成と一致しました。これらの特性評価結果は、フラーレノールの合成成功を確認するものです。

TPE下での水溶性フラーレノールによるROS生成

光感作剤（PS）は光エネルギーを吸収し、他の非吸収分子に移転してROSを生成し、標的細胞を殺傷し、腫瘍血管を損傷し、抗腫瘍免疫応答を活性化します。PSは分子軌道における電子の特定の配列を持ちます。ほぼすべての分子と同様に、基底（単重項）状態では、PSは低エネルギー分子軌道に逆スピンを持つ電子対を持ちます。適切な波長の光吸収により、スピンを変えずに電子が高エネルギー軌道に励起されます。これは寿命の短い（ナノ秒）励起単重項（S₁)状態であり、PSは光放出（蛍光）または熱によりエネルギーを失って基底状態に戻れます。あるいは、励起電子のスピンが反転する系間交差がS₁状態で起こり得ます。この電子スピン反転は、励起三重項（T₁)状態の比較的長い寿命（マイクロ秒持続）の原因となります。三重項-単重項遷移は電子スピン変化を必要とするため遅いプロセスであり、放射的遷移は抑制されます。T₁状態から、PSは光放出（リン光）または他の分子へのエネルギー移転により基底状態に戻れます。他の分子と衝突する際に内部変換や放射なし遷移でエネルギーを失うこともできます。PSのT₁状態での寿命が長いほど、他の分子と衝突する機会が増え、ROS生成が高まります[57-59]。水溶性フラーレノールの光感作は、長寿命T₁状態への遷移と分子酸素へのエネルギーまたは電子移転をもたらし、¹O₂やO₂^·−などのROSを生成します。これらはPDTで主要な役割を果たします。したがって、¹O₂とO₂^·−が水溶性C₆₀(OH)₄₆により生成されることを、レーザー照射を用いて直接検出する必要があります。PDT中の¹O₂とO₂^·−形成を検出するため、本研究では励起三重項水溶性C₆₀(OH)₄₆、酸素、適切な波長とエネルギーに設定された光を組み合わせ、SOSG、t-MVP、XTT、GSH試薬を導入することでPDTを開始しました[33,34,49-51]。材料の潜在的殺菌能力を活用するため、約760 nmの波長が水溶性C₆₀(OH)₄₆のTPE下での相対最大TPA比を導出するのに最も効率的であると決定されました（図3a）；これは帯間遷移に起因すると考えられます[52]。この波長を本研究の後続実験で使用しました。水溶性C₆₀(OH)₄₆を、211.2 nJ/pixel、800回走査（励起760 nm；総有効露光時間約3.2621秒）、投与濃度3または6 μg/mLでTPE光励起しました（追加ファイル1：表S2）。さらに、水溶性C₆₀(OH)₄₆のPDT効果におけるROSの関与を確認するため、α-トコフェロールでROS中和を行いました[49,53]。α-トコフェロール添加後、生成ROS量は減少しましたが、予想通り細菌生存率は増加しました。また、生成ROS量は投与濃度に依存しました。水溶性C₆₀(OH)₄₆が白色光に偶発的に曝露されて¹O₂とO₂^·−が生成される可能性を防ぐため[60]、後続PDT実験は暗所で実施しました。本研究は生成¹O₂とO₂^·−の量に焦点を当てました。水溶性C₆₀(OH)₄₆は相当な抗菌効果を示し、PDTへの応用可能性を示唆しました。特筆すべきは、同じ実験後、水溶性C₆₀(OH)₂₁（追加ファイル1：図S3、S4；図3a）は、水溶性C₆₀(OH)₄₆（追加ファイル1：表S2）と比較して¹O₂とO₂^·−の形成において効果が低かったことです。水溶性C₆₀(OH)₄₆は水溶性C₆₀(OH)₂₁より多くの¹O₂とO₂^·−を生成しました。また、水溶性C₆₀(OH)₄₆とC₆₀(OH)₂₁のΦ_Δ値はそれぞれ約0.93と0.85でした（参考までに、Φ_Δ = 0.64はD₂Oに溶解したTSPPのQY[29,30]）。

TPEを用いた抗菌能力決定

抗菌実験実施前に、水溶性フラーレノールの毒性を検討し、細菌除去に寄与し実験結果を交絡させる因子を除外する必要があります。また、実験材料が白色光に偶発的に曝露されることでROS生成が起こり、実験結果を交絡させる可能性を防ぐため[35]、PDT実験は暗所で実施する必要があります。本研究ではグラム陰性菌E. coliを実験テンプレートとして適用しました。CFU計数アッセイで生存菌数を決定（本稿ではパーセンテージで表現、CFU/mLに対応）。細菌を2種類の調製水溶性フラーレノール（濃度範囲0–9 μg/mL）で処理し、37℃で暗所にて3時間インキュベートして600 nm吸光度を測定（OD₆₀₀ ~ 0.05；追加ファイル1：図S1）。材料処理細菌の増殖レベルを最初に600 nm吸光度測定でモニタリング。初期吸光度は0.05 OD₆₀₀で、両材料で時間経過とともに約0.37に達しました。したがって、どちらの材料も細菌増殖を阻害しませんでした。また、材料は生存菌数でほぼ0 log₁₀減少をもたらしました（図3b）、生存率約100%に対応（図3c）。したがって、材料は細菌と優れた生体適合性を示すと判断されました。結果として、37℃で暗所にて3時間インキュベートした材料を実験に使用しました。水溶性フラーレノールはROSを生成できますが、材料と試薬（SOSG、t-MVP、XTT、GSH）の相互作用により偽陽性ROSシグナルが生じ、PDT結果を交絡させる可能性があります[52]。したがって、この可能性を除外するため、本研究では細菌を導入し材料で処理しました。光励起材料処理E. coliから生成されるROS量を観察しました。表2に観察されたROS量を示し、追加ファイル1の表S2–S3（材料単独と材料処理グラム陽性菌Bacillus subtilis（B. subtilis））と類似の傾向を示しました。これらの結果は、材料から放出される1270 nmでの¹O₂リン光シグナルと一致しました（図3d）。E. coliに対するPDTを、低エネルギー照射（211.2 nJ/pixel、800回走査、総有効露光時間約3.2621秒；励起760 nm）で実施。二光子光励起材料処理E. coliの生存率へのPDT効果を決定しました（図4）。細菌単独（レーザー曝露あり/なし）またはレーザー処理なしの材料処理細菌パネルでは殺菌効果は観察されませんでした（図4a）。TPE後、細菌生存率は比較的低く、具体的には水溶性C₆₀(OH)₂₁処理パネルで観察された生存率はほぼ15%で、約0.823 log₁₀減少に対応（図4b）。対照的に、水溶性C₆₀(OH)₄₆処理パネルで観察された細菌生存率は約0%（100%除去効率、約7.736 log₁₀減少に対応）でした。投与濃度を増加させると、両材料で完全な殺菌効果が観察されました（図4c、d）。しかし、光励起後は細菌タイプ（グラム陰性E. coliまたはグラム陽性B. subtilis）による抗菌効果の差はありませんでした（追加ファイル1：図S5）。また、細菌を除去したフラーレノールについて、同一処理条件下では水酸基組成が高い方が低いものと比較して殺菌能力が高まりました。

TEMによる水溶性フラーレノール処理E. coliの観察と二光子特性の調査

光励起後の材料処理細菌の破壊を観察するため、高いPDT効率を示した水溶性C₆₀(OH)₄₆を選択し、TEMで細菌をイメージングしました。無処理E. coli（図5a）を水溶性フラーレノールで3時間インキュベートすると、細菌表面に材料が実質的に吸着しました。しかし、異常な形態は観察されず、正常な生菌形態を示しました（図5b）。取り込みアッセイ結果は、細菌表面への材料吸着を明らかにし、対応するバースト率はインキュベーション最初の3時間で約85%でした（図5c）；3時間目から10時間目で飽和に達しました。したがって、材料は吸着し細菌表面に外部バリアを形成しました。しかし、E. coliは3日間のインキュベートで歪んだ外観と深刻な形態変化を示しました（図5d）、0.940 log₁₀減少に対応し、ほぼ18%の生存率となりました（図5f；追加ファイル1：図S6）。材料の細菌表面への吸収とコーティングは、微生物増殖に必須な栄養素の吸収を抑制し、膜（壁）透過性に変化をもたらし、内部浸透圧バランスの乱れを誘発し、微生物増殖を阻害しました。つまり、水溶性フラーレノールは3日間のインキュベーション後に抗菌（静菌的または殺菌的）効果を持ちました。さらに、光励起材料処理細菌、特にE. coliは、3時間のインキュベーション後に独特な形態で深刻な損傷を示しました（図5e、f；追加ファイル1：図S6）。細菌表面に熱由来の気泡は形成されず、水溶性フラーレノールが光励起後には光熱媒介熱特性を持たないことを示しました（追加ファイル1：図S7）。E. coliの生存率は蛍光と定量化でも決定されました（図6）。図6aの生菌を示す緑色蛍光は、レーザー単独曝露菌がほぼ無傷であることを示し、これは図5aの結果と一致します。死菌は材料とレーザー曝露処理後に検出可能でした（図6bの赤色蛍光）、これは図5eの所見とも一致します。細菌生存率をさらなる抗菌試験用に定量化。材料処理細菌のほぼ完全除去を観察（図6c）。生存率はCFUアッセイ（図4a、b、5f、追加ファイル1：図S6）でも定量化し、PDTにおける水溶性C₆₀(OH)₄₆の抗菌効率を実証しました。図4、5、6、表2、表S2（追加ファイル1）の結果によれば、水溶性C₆₀(OH)₄₆処理E. coliは光励起に感受性が高く、水溶性C₆₀(OH)₂₁処理と比較してより高い死亡率、ROS生成増加、より深刻な形態崩壊を示しました。一般的に、TPEの絶対クロスセクションは、試料に吸収されるエネルギーと入力エネルギーフラックスの比率が高いため、フロロフォアを非線形顕微鏡研究に効率的にします[39,40]。二光子技術を用いて生きた生物学的試料や濁った組織の分子活性をイメージングする際、好ましいクロスセクションが望まれます[61]。本研究では、水溶性C₆₀(OH)₄₆のTPE絶対クロスセクションを760 nm励起波長で約1037 GM（ゲッペルト・マイヤー単位、1 GM=10⁻⁵⁰ cm⁴ s photon⁻¹）と算出しました（フルオレセインをクロスセクションの標準基準として使用[39,40]；図1bと表1、3）；水溶性C₆₀(OH)₂₁の絶対クロスセクションは約1230 GMで、関連研究[62,63]で得られた値と類似でした。これらの絶対クロスセクションは二光子プロセスを促進できる可能性があります。さらに、水溶性C₆₀(OH)₄₆の蛍光は二光子プロセスで照明されました（図1b）。相対蛍光QYは約0.02（Cy5.5のDMSO中QY[31]を基準：QY_ref=0.28）；同様に絶対QY[64]は約0.01で、OPEとTPEで同じQYが得られました[31]。対照的に、水溶性C₆₀(OH)₂₁はより低い相対・絶対QY（0.06と0.05）を示しました。また、本研究ではフラーレノールの寿命を調査しました。放射的・非放射的崩壊率がQYと寿命に及ぼす影響を計算しました。水溶性C₆₀(OH)₄₆の平均寿命は、観察された寿命0.149、1.775、19.679 nsから約7.797 nsと算出されました；水溶性C₆₀(OH)₂₁の平均寿命は約5.251 nsでした（図7と表4）。したがって、水溶性C₆₀(OH)₄₆の放射的対非放射的崩壊率比は約0.020（約2.565×10⁶ s⁻¹対1.257×10⁸ s⁻¹から導出）、水溶性C₆₀(OH)₂₁は約0.064（約1.143×10⁷ s⁻¹と1.790×10⁸ s⁻¹；追加ファイル1：表S4）でした。この所見は、水溶性フラーレノール表面の水酸基の存在が電子-正孔対の非放射的再結合を誘導し、固有状態放出を阻害することに起因します。しかし、水溶性フラーレノール縁の水酸基は高い占有分子軌道を持つ可能性があります。これは水酸基間の強い軌道相互作用に起因し、それにより系間交差（蛍光生成ではなく）効率を高め、水酸基組成の高い多数のナノ材料三重項を生成するためです。したがって、水溶性フラーレノールは高いΦ_Δ値を持ち、ヤブロンスキー図[65]に従って酸素と反応します。結果として、二光子PDTを超低エネルギーで極めて短時間で効果的に実施でき、悪性種を殺傷する代替アプローチを提供します。

結論

本研究では、水酸基組成が高い水溶性フラーレノール材料が、水酸基組成が低いフラーレノール材料より優れた光特性を持つことが明らかになりました。優れた光特性は、治療に必要なレーザー曝露と材料量が減少することに起因します。さらに、水酸基組成が高い水溶性フラーレノールは高いTPA、好ましいTPE絶対クロスセクション、高い二光子安定性を示しました。したがって、このフラーレノールはTPEと組み合わせた二光子PDTにおける二光子PSとしての潜在能力を持ちます。この特性はおそらく、水溶性フラーレノール表面の水酸基の存在が電子-正孔対の非放射的再結合を引き起こし、固有状態放出を阻害することに起因します。さらに、水溶性フラーレノール縁の水酸基は高い占有分子軌道を持つ可能性があります。これは水酸基間の強い軌道相互作用に起因し、それにより系間交差（蛍光生成ではなく）効率を高め、水酸基組成の高い多数の材料三重項を生成します。したがって、水溶性フラーレノールは高いΦ_Δ値を持ち、ヤブロンスキー図に従って酸素と反応します。結果として、二光子PDTを超低エネルギーで極めて短時間で効果的に実施できます。したがって、悪性種を管理するこの効率的な代替アプローチは、将来の臨床応用の可能性を示しています。