生体適合性FePO4ナノ粒子：ドラッグデリバリー、RNA安定化、および機能的活性

はじめに

金、シリカ、量子ドットなどのさまざまな無機ナノ粒子の中で、鉄ベースのナノ粒子（Fe-NP）は、造影剤、ドラッグデリバリービヒクル、熱ベースの治療法などの生物医学的用途で広く研究されています[1,2,3]。磁気特性、高い生体適応性、および鉄の既知の内因性代謝のために、Fe-NPは生物医学的用途の望ましい候補です。そのため、Fe-NPはFDA承認の無機ナノメディシンの大部分を占めています[1、2]。これらには、INFeD、DexFerrum、Ferrlecit、Venofer、Feraheme、およびInjectaferが含まれ、これらは鉄欠乏性貧血および慢性腎臓病の鉄欠乏症への応用のために市販されています[1]。同様に、グルコン酸鉄キレートの静脈内投与は、貧血に対する忍容性の高い介入です[4]。貧血は、世界で最も蔓延している栄養不足の1つであり、FePO ₄ のようなFeベースのナノ粒子です。 およびFeSO ₄ 貧血を防ぐために栄養強化に使用されています。栄養強化は、人口の栄養不足を克服することを目的として、食品に微量栄養素を加えるプロセスです[5]。 FePO ₄ NPは、生体適合性、高いバイオアベイラビリティ、および官能的な悪影響を引き起こさない優れた感覚性能のために、食品強化に特に関心があります[6、7、8、9]。 Perfecto etal。 FePO ₄ を実証しました ヒト腸細胞におけるNPの内在化は、主に二価金属トランスポーター-1（DMT-1）を介して発生するため、容易に吸収されます[9、10]。鉄ベースのFeridex®およびRevosit®は、造影剤増強MRIに広く使用されている磁気共鳴画像法（MRI）造影剤です[11、12、13、14、15、16]。これらの優れたレポートに照らして、FePO ₄ NPは、優れた配信手段としての地位を確立しています。ここでは、FePO ₄ について説明しました。 抗がん剤であるドキソルビシン（DOX）をロードすることによるドラッグデリバリービヒクルとして。第二鉄イオン（Fe ³⁺ ）FePO ₄ の電子不足Fe間の静電相互作用によって促進されるDOX分子と複合体を形成することができます DOXに電子が豊富な–OH基があり、DOXをロードしたFePO ₄ を形成します。 NP：FePO ₄ -DOXNP。 FePO ₄ の物理化学的性質を評価しました およびFePO ₄ -DOX NPと、マウス骨肉腫K7M2および線維芽細胞NIH / 3T3細胞株における生体適合性および細胞毒性プロファイルをそれぞれ評価しました。

それに加えて、無機ナノ粒子は、核酸の安定化と送達において有望であることが示されています[17、18、19]。この点に関して、金ナノ粒子は、オリゴヌクレオチドを表面に固定化して分子の凝集と分解を防止する能力があるため、広く研究されてきました[17、20]。ただし、金は内在性元素ではないため、その翻訳用途が制限される可能性があります。ここでは、FePO ₄ のようなFeベースのナノ粒子 ナノ粒子は、その内因性の性質と確立された生体適合性プロファイルのために、RNA安定化研究にとって最も重要な場合があります。安定化のための核酸（RNA / DNA）とFe-NPの相互作用の2つの提案されたメカニズムがあります-（1）水素結合の形成と核酸骨格のリン酸基とFe-NP間の静電相互作用が核酸の吸着をもたらしますFe-NP中の酸、および（2）核酸は、ヌクレオチド塩基対の相互作用を介してFe-NP表面に吸着する可能性があります[19、21、22]。ある研究では、DNAワクチンの安定化と送達のためのリン酸カルシウムナノ粒子の可能性が示されています[23]。この点に関して、ここでは、別のリン酸塩ベースのナノ粒子であるFePO ₄ のRNA安定化と機能的活性を調査しました。 、FePO ₄ の多機能ポテンシャルを調査する 貨物の配送と安定化におけるナノ粒子ベースのナノ粒子。

COVID19に対するmRNAワクチンの迅速な承認により、mRNAワクチンナノ粒子は非常に興味深いものであり、RNAは急速な加水分解と機能的発現の喪失にさらされており、これらの重要な特性を改善するのはナノ粒子の責任です。ここでは、FePO ₄ を示します NPはRNAを安定させ、機能的なmRNA翻訳をサポートします。これらの優れた特性を考えると、FePO ₄ NPは、食品の強化、薬物、およびRNAの送達を検討する価値があり、刺激的な生物医学的応用を可能にします。

結果と考察

FePO ₄ NPの合成、特性評価、および生体適合性分析

（NH ₄ 間の単純なワンステップ化学反応 ） ₃ PO ₄ およびFe（NO ₃ ） ₃ FePO ₄ を与える FePO ₄ の安定化に役立つ生体適合性脂質-PEG界面活性剤に分散する沈殿物として ナノ粒子と凝集を防ぎます。 FePO ₄ NPは、175±5 nmの流体力学的サイズを示し、多分散度指数（PDI）は0.150±0.01であり、良好な粒子均一性と狭いサイズ分布を示しています。ゼータ電位分析は、FePO ₄ の負の表面電荷を示しました −19.1±8mVのゼータ電位を持つNP。負の表面電荷はさらにコロイド中の粒子を安定化させるのに役立ち、それによってタンパク質のオプソニン作用を防ぎます。これは、細胞の標的化を防ぎ、薬物動態を変化させるメカニズムです[24、25、26]。 FePO ₄ FTIRによってさらに特徴づけられました。図1cは、FePO ₄ のスペクトル特性を示しています。 ナノ粒子とその前駆体-Fe（NO ₃ ） ₃ および（NH ₄ ） ₃ PO ₄ 。 FePO ₄ スペクトルは、1030 cm ^-1 に明確な鋭いピークを示しています これは、P–O伸縮バンド、520 cm ^-1 の小さなピークに起因する可能性があります。 O–P–O反対称曲げに対応し、3000〜3500 cm ^-1 の広い範囲 吸着された水分子からの水の曲げおよび伸縮振動を表します[27、28]。 FePO ₄ スペクトルはPO ₄ の存在を示しました ^3- グループであり、他の研究で報告されたFTIRピークに類似しているため、FePO ₄ の形成が確認されます。 ナノ粒子[27、28、29]。 Fe（NO ₃ ） ₃ スペクトルは、1326および813 cm ^-1 にN–O伸縮バンドの特徴的なピークを示しました。 [30]。 1625のピークは、–OH曲げ振動と3000 cm ^-1 付近の広いピークに起因する可能性があります。 水の曲げ振動と伸縮振動に起因する可能性があります[30]。同様に、（NH ₄ ） ₃ PO ₄ 1500 cm ^-1 付近にアンモニウム基の特徴的なピークを示しました リン酸基は約1000cm ^-1 [31]。 FePO ₄ に硝酸塩とアンモニウムのピークがない ナノ粒子は、製品に副産物がないことを示唆し、合成の純度を確認します。

FePO ₄ の特性評価と生体適合性 ナノ粒子。 a FePO ₄ の流体力学的サイズ分布 NP、 b FePO ₄ のゼータ電位測定 表面電荷を示すNP、 c FePO ₄ のFTIR NPとその前駆体-Fe（NO ₃ ） ₃ および（NH ₄ ） ₃ PO ₄ 、および d FePO ₄ の生体適合性 マウス骨肉腫K7M2およびマウス線維芽細胞NIH / 3T3細胞株のNP。 NPはさまざまな濃度で48時間処理されました（ a、b データは平均±s.d。を表します。 n =3回繰り返します。 d 平均±s.d。、 n を表します =6回の繰り返し）。

FePO ₄ の合成の成功、純度、良好なサイズの均一性、および安定した表面電荷が保証されています。 NP、FePO ₄ の生体適合性の分析を続けました NP。この目的のために、癌細胞と非癌細胞を使用しました。マウス骨肉腫K7M2とマウス線維芽細胞NIH / 3T3を使用し、MTTアッセイを使用して細胞生存率の観点からさまざまな濃度のNPの生体適合性を分析しました。 FePO ₄ NPは、K7M2とNIH / 3T3の両方の細胞株で、20〜600 µg / mLの濃度範囲で濃度依存性の生体適合性を示しました（図1d）。 FePO ₄ NPは、80 µg / mLの濃度まで良好な生体適合性を示し、細胞生存率は70％を超えました。生体適合性は、癌細胞K7M2と比較して非癌細胞NIH / 3T3で比較的高かった。

FePOでのドキソルビシンのロード ₄ およびFePO ₄ の細胞毒性 -DOX

ドキソルビシンはFePO ₄ にロードされます ドキソルビシン溶液をFePO ₄ の前駆体と混合する共培養沈殿法による その結果、DOXをロードしたFePO ₄ が形成されます。 。メソッドで説明されているように、DOXをロードするための3つの異なる定式化が採用されています。製剤1は26.81％±1の最高の負荷効率を示しましたが、製剤2は8.83％±2の負荷効率を示し、製剤3は負荷を示しませんでした（図2a）。ロードのために、前駆体Fe（NO ₃ ）にDOX溶液を追加しました ） ₃ 製剤1および（NH ₄ ） ₃ PO ₄ 製剤2では、製剤3では、FePO ₄ にDOX溶液を追加しました。 直接NP。読み込みデータは、FePO ₄ にDOXを追加することを明確に示しています NPはDOXを保持しませんが、DOXをいずれかの前駆体に追加します：Fe（NO ₃ ） ₃ および（NH ₄ ） ₃ PO ₄ ソリューションは、DOXのロードと保持に役立ちます。これは、Fe ³⁺ Fe（NO ₃ ） ₃ ドキソルビシンに存在する電子豊富な酸素基と複合体を形成することができます[32、33]。 Fe ³⁺ -次に、（NH ₄ ） ₃ PO ₄ 結果としてFePO ₄ -DOXは、かすかな黄色からかすかな茶色への色の変化を特徴としています（図2b）。色の変化にもかかわらず、FePO ₄ の発光スペクトルに変化はありませんでした。 -480 nmで励起した場合、FreeDOXと同様の590nmでの発光最大値を示したDOX（図2c）。 FePO ₄ -DOX NPは、FePO ₄ と同様に、187±7nmの流体力学的サイズと0.143±0.02のPDIを示しました。 （図2d）。ただし、FePO ₄ の表面電荷には大きな違いがありました。 -FePO ₄ と比較したDOXNP（-8.89±5 mV） NP（-19.1±8 mV）（図2e）。ゼータ電位の変化は、ナノ粒子の表面特性の機能的変化を示唆しています。ここで、ゼータ電位の-19.1から-8.89 mVへの低下は、複合体にカチオン特性を追加するDOX複合体形成に起因する可能性があります。

FePO ₄ にロードされているドキソルビシン（DOX） NPとFePO ₄ の特性 -DOX。 a FePO ₄ の3つの異なる製剤におけるDOXローディング効率 NPおよびDOX、 b FePO ₄ にDOXをロードした後の黄色から茶色への色の変化の図解 FePO ₄ を配合する -DOX、 c DOXをロードしたFePO ₄ の発光スペクトルの特性評価 NP（FePO ₄ -DOX）480 nmで励起した後、 d FePO ₄ の流体力学的サイズ分布 -DOX NP、および e FePO ₄ のゼータ電位の特性評価 -表面電荷を示すDOXNP（データは平均±s.d。; n を表します =3回の繰り返し）

物理化学的特性評価に続いて、FePO ₄ の細胞毒性 -DOXはK7M2およびNIH / 3T3細胞で分析され、遊離DOXと比較されました（図3）。 FePO ₄ -DOXは、両方の細胞株で同等のDOX濃度で遊離DOXと比較して高い細胞毒性を示しました。 IC50値は、FePO ₄ で約10分の1の減少を示しました -DOX処理、NIH / 3T3では2.61〜0.248 µM、K7M2セルでは1.01〜0.107 µM。両方の細胞株におけるIC50値のこの劇的な減少は、FePO ₄ の細胞毒性プロファイルの強化を示唆しています。 -DOXNP。同等のFePO ₄ FePO ₄ のIC50濃度範囲の濃度 -DOXは40µg / mL（K7M2セルでは0.107 µM）と100 µg / mL（NIH / 3T3セルでは0.248µM）であり、どちらもFePO ₄ の生体適合性の範囲内です。 濃度、70％以上の細胞生存率。したがって、FePO ₄ の標高 -DOXの細胞毒性は、Fe ³⁺ に起因する可能性があります -DOX複合体の形成であり、FePO ₄ の個々の寄与ではありません およびDOX。文献は、鉄の存在下でのドキソルビシンのようなアントラサイクリンの細胞毒性効果の上昇を示しています[34、35、36、37]。これらの報告は、鉄キレート剤の使用によるFe-DOX細胞毒性の軽減によってさらに裏付けられています[35、36、37]。提案されているメカニズムの1つは、Fe-DOX複合体がDOX由来の活性酸素種（ROS）の毒性を増強し、比較的安全なROS（O ^2・ ）を変換することです。 –およびH ₂ O ₂ ）DNA損傷と細胞死の上昇につながるはるかに毒性の高いROSになります[34、36]。別の提案されたメカニズムは、過剰な鉄の存在下での鉄調節タンパク質およびフェリチンの機能とのDOXの相互作用であり、それによって鉄の恒常性に影響を及ぼし、ROS依存性および非依存性の損傷およびアポトーシス細胞死をもたらす[36、38]。

FePO ₄ の細胞毒性 -DOXNP。 a、b 遊離ドキソルビシン（DOX）およびFePO ₄ の細胞毒性 -さまざまなDOX相当濃度のマウス線維芽細胞NIH / 3T3および骨肉腫K7M2細胞株におけるDOXNP。細胞毒性は、48時間の粒子処理後の細胞生存率で分析されました。 c、d FePO ₄ の細胞生存率の比較 -同等のDOX濃度でのNIH / 3T3およびK7M2細胞株におけるそれぞれのDOXNPおよび遊離DOX。中央の挿入図は、FreeDOXおよびFePO ₄ のIC-50値を表しています。 -NIH / 3T3およびK7M2セルのDOXNP（データは平均±s.d。; n を表します =6回の繰り返し）

細胞毒性の上昇に加えて、FePO ₄ -DOXは、遊離DOXと同様の細胞毒性挙動が高い癌細胞に対して選択性を示しました。図3cは、0.1 µMDOXに相当するFePO ₄ を示しています。 -DOXは、非癌NIH / 3T3の72％の細胞生存率と比較して、癌細胞K7M2の53％の細胞生存率を示しました。同様に、Free DOXも癌細胞に対してより高い細胞毒性挙動を示し、NIH / 3T3の66％と比較してK7M2細胞では54％の細胞生存率を示しました。ただし、FePO ₄ の場合は差が大きくなっています。 -DOX、遊離DOXの12％と比較して、癌細胞と非癌細胞の間で細胞生存率に19％の違いがあります。細胞毒性分析は、FePO ₄ におけるDOXとのFe複合体形成を示しています -DOX NPは、細胞毒性を大幅に強化し、癌細胞に対する選択性を向上させました。

FePOの細胞内在化 ₄ -DOX NP

FePO ₄ の内部移行動作 -DOX NPは、時間依存の内在化研究に続いて、共焦点顕微鏡を使用して分析されました（図4）。陽性対照として遊離DOXを使用した。両方のFePO ₄ -DOXNPおよびFreeDOXは、最初の0.5時間および1時間のインキュベーション時点で有意な内在化を示しませんでした。ただし、3時間のインキュベーションでは、共焦点画像の赤いDOX蛍光で示されるように、両方とも内在化を示しました。青い色は、DAPIによる核染色に由来します。分析によると、3時間以内にFePO ₄ -DOX NPは、FreeDOXと同様の内部移行動作に従って細胞に内部移行します。 FePO ₄ の色の変化により、注意することが重要です。 -DOXは、Free DOXの赤色と比較して茶色がかっているため、FePO ₄ の相対的な内部移行プロファイルを定量的に比較できない場合があります。 -DOX。それにもかかわらず、内在化アッセイにより、FePO ₄ -DOXは3時間以内に細胞に取り込まれます。私たちの体が鉄を処理するメカニズムがよく理解されていることを考えると、提案されたNPは、単一の治療セッションで治療反応を監視する能力を備えた鉄ベースの抗癌治療法の開発に有望である可能性があります。

細胞内在化研究。 FePO ₄ の細胞内在化 -3時間、1時間、および0.5時間の処理後のK7M2細胞上のDOXNPおよびFreeDOX。細胞を200µLの5 µg / mLDOX濃度で処理しました。ナノ粒子で処理された細胞株で観察された赤色は、ナノ粒子の内部移行が成功したことを示しています。赤色はDOXの蛍光特性によるものです。未処理のコントロールセルでは赤い信号は観察されません

RNAの安定化とmRNAの発現

図5aに示されているように、銅ナノ粒子（Cu NP）とカーボンナノチューブ（CNT）はRNAの加水分解を加速します（コントロールよりも低いバンド強度）が、FePO ₄ 制御銀（Ag）ナノ粒子は、RNAアガロースゲル電気泳動（RAGE）で比較的強いバンド強度によって示されるように、RNAを安定化します。 FePO ₄ 対照の酸化亜鉛ナノ粒子（ZnO NP）も、対照よりもわずかに高いバンド強度で示されるように、血清中の分解に対してある程度の耐性を付与します（図5b）。重要なのは、機能的活性であるmRNA発現は非ナノ粒子コントロールよりも高いのに対し、RNA分解Cu NPは、相対光単位で測定するとmRNA発現の損失を引き起こします（図5c）。これらの結果は、FePO ₄ NPはRNAの安定化に役立ち、治療用RNA送達の安定化送達剤として使用できます。以前の予備実験では、示されている通常の動作範囲は、代表的な2393および2630 RLU /ウェルを示す対照の非ナノ粒子処理サンプルの2つの独立した実験であることが示されていました。上記のデータと一致する2倍の増加は、FePO44 NPが翻訳をサポートするのに対し、上記のRNAの変性/分解と一致すると、CuNPは翻訳を抑制することを示唆しています。さまざまな無機ナノ粒子システムが、以下を含む治療用RNAの安定化と送達に利用されてきました。金、銀、銅、酸化鉄、メソポーラスシリカナノ粒子（MSN）、炭素ベースのポリマー、複合材料など[39–45]。たとえば、私たちのグループは、高分子RNAへのナノ粒子の複合体形成がRNase、または血清や組織に存在するヌクレアーゼによる分解に抵抗する原因となる可能性があることを報告しました。 COVID-19 mRNAワクチンは、ワクチンを超えて広がるこのような高分子RNA療法への関心を新たにしました。ここでは、RNAを加水分解やヌクレアーゼを介した消化から保護するだけでなく、NPへの複合体形成によってRNA機能を維持する必要があります。 、mRNA発現。以前、銅ナノ粒子複合体形成高分子RNAがRNA変性を引き起こすのを見てきました[46]。したがって、トルラ酵母RNA（TY-RNA）またはルシフェラーゼを発現するレポーターコンストラクトmRNAを使用して、高分子RNAへのNP複合体形成の影響を調査しました。

RNAの加水分解。 a トルラ酵母由来のほとんどのmRNA（TY-RNA）とサイズおよび配列組成が類似している多くの出版物で使用したモデルRNAを使用しました。 RNAは、銅（Cu NP）、リン酸鉄（FePO4）、銀（Ag NP）、またはカーボンナノチューブ（CNT）のいずれかのナノ粒子の存在下または非存在下で、37度で時間の経過とともに再蒸留水中でインキュベートされ、サンプルは同じ時点で、RNAアガロースゲル電気泳動（RAGE）によって分析されます。バンド染色強度の喪失はRNA分解を示し、RNAバンド染色強度の維持は安定化を示します。 b 上記と同様に、RNAは酸化亜鉛（ZnO）NPまたはFePO ₄ の存在下、室温で10％FBS / DMEMで培養されました。 ナノ粒子の非存在下でRNAのみであったNP対対照。この場合も、サンプルを経時的に除去し、RAGEでアッセイしました。染色されたRNAバンドの経時的な存在は、ヌクレアーゼまたは血清からのRNase分解による安定性と耐性を示しています。 c ルシフェラーゼをコードするmRNAは、標準的なウサギ網状赤血球からin vitroで翻訳され、相対発光はリン酸鉄（FePO ₄ ）の存在下または非存在下でRNAに標準化されました。 ）または銅（Cu）ナノ粒子

結論

FePO ₄ ナノ粒子は、単純な共培養-沈殿技術に従って正常に合成され、175±5nmの均一なサイズの粒子が形成されました。 FTIR分析により、ナノ粒子にリン酸基が存在し、前駆体不純物が存在しないことが確認されました。生体適合性分析により、80 µg / mLまでの細胞生存率が70％を超える、濃度依存性の生体適合性が明らかになりました。さらに、DOXはFePO ₄ に効果的にロードされました 結果としてFePO ₄ -FePO ₄ と同様の物理化学的特性を示したDOXNP 。細胞毒性分析により、FePO ₄ におけるFeとDOXの複合体形成が明らかになりました -DOX NPは細胞毒性を増強し、IC50が約10倍向上し、癌細胞に対する選択性が向上しました。さらに、内在化アッセイはFePO ₄ を示しました -DOX NPは、3時間のインキュベーション時点で細胞内に効率的に内在化されました。 RNA安定化研究はFePO ₄ ナノ粒子はRNAを効率的に安定化し、急速な分解を防ぎ、治療用RNAの送達の可能性を示す機能的活性を維持します。良好なサイズの均一性、生体適合性の範囲、薬物負荷効率、強化された細胞毒性プロファイル、RNA安定化特性、および効率的な細胞取り込みを考えると、FePO ₄ NPは、薬物およびRNA送達媒体に望ましい特性を示しました。さらに、結果は、FePO ₄ を使用する有望な見通しを示しています。 -食品ベースの薬物プラットフォームの開発のための食品強化における薬物NP。

メソッド

FePOの合成と特性評価 ₄ ナノ粒子

FePO ₄ ナノ粒子は、Sokolovaらによる化学沈殿技術最適化プロトコルによって合成されました。 [47]。簡単に説明すると、リン酸アンモニウム（（NH ₄ ） ₃ PO _4、 16 mg / mL）および硝酸鉄（Fe（NO ₃ ） _3、 8 mg / mL）溶液を調製しました。 1 mLのFe（NO ₃ ） ₃ 、1 mLの（NH ₄ ） ₃ PO ₄ 一定の攪拌下で滴下すると、リン酸鉄（FePO ₄ ）が沈殿しました。 ）。 （NH ₄ の超過 ） ₃ PO ₄ すべてのFeがFe（NO ₃ ） ₃ FePO _4。として沈殿します このように形成されたリン酸鉄溶液を水で3回洗浄し、300 gで2分間遠心分離して、副産物を除去しました。最後に、FePO ₄ 沈殿物をDSPE-PEG-COOH溶液（10％w / w）で水中に分散させ、FePO ₄ を配合しました。 ナノ粒子。 FePO ₄ NPは、動的光散乱（DLS）を使用してサイズと表面特性を特性評価し、フーリエ変換赤外分光法（FTIR）を使用してスペクトル特性を特性評価しました。

FePOにドキソルビシン（DOX）をロード ₄ ナノ粒子

ドキソルビシンはFePO ₄ にロードされました 共培養沈殿法によるナノ粒子。 3つの異なるDOX-FePO ₄ 最高のローディング効率を最適化するために、NPの配合が検討されました。最初の処方では、DOX-FePO ₄ NPは、1mLのFe（NO ₃ ）に100 µgのDOXを添加して配合しました。 ） ₃ （8 mg / mL）に続いて、1 mLの（NH ₄ ） ₃ PO ₄ （16 mg / mL）一定の攪拌下で滴下します。 2番目の製剤では、最初に100 µgのDOXを1 mLの（NH ₄ ） ₃ PO ₄ （16 mg / mL）に続いて1 mLのFe（NO ₃ ） ₃ （8 mg / mL）一定の攪拌下で滴下します。 3番目の製剤では、100 µgのDOXをFePO ₄ に追加しました。 NPソリューション。このように処方されたFePO ₄ -DOXNPを水とFePO ₄ 中のドキソルビシンの量で3回洗浄しました。 -DOXは、490nmと595nmでDOXの励起と発光を測定することにより、分光蛍光光度法で定量化されました。

DOXの負荷効率は、次の式で計算されました。

FePOの生体適合性 ₄ NPとFePOの細胞毒性 ₄ -DOX NP

FePO ₄ の生体適合性 NPとFePO ₄ の細胞毒性 -DOX NPは、確立されたプロトコルに従ってMTTアッセイを使用して、マウス骨肉腫K7M2およびマウス線維芽細胞NIH / 3T3でアッセイされました[48、49]。簡単に説明すると、10,000個の細胞を96ウェルプレートに播種し、37°C​​の5％CO ₂ で24時間インキュベートしました。 インキュベータ。次に、培地を除去し、ナノ粒子の濃度を変化させた新鮮な培地を細胞に処理し、48時間培養しました。対照細胞は培地のみで維持された。 FePO ₄ NPの濃度は20〜600 µg / mLの範囲で、DOXの濃度は0.05〜5 µMの範囲です。 NPインキュベーション後、培地を除去し、細胞を無血清培地中のMTT溶液（0.5 mg / ml）と2時間インキュベートして、ホルマザン結晶を形成させました。 MTT溶液を除去し、ホルマザン結晶をDMSOに溶解し、適切に混合するために室温で15分間放置しました。次に、マイクロプレートリーダー（BioTek、Synergy H1ハイブリッドリーダー）を使用してDMSO溶液の吸光度を550 nmで測定し、細胞生存率を計算しました。

共焦点顕微鏡による細胞内在化

FePO ₄ の細胞内在化 -DOX NPは、共焦点顕微鏡を使用してマウス骨肉腫K7M2細胞で分析されました[49,50,51]。簡単に説明すると、12,000個の細胞を8ウェルプレートに播種し、37°C​​の5％CO ₂ で24時間インキュベートしました。 インキュベータ。次に、培地中の5 µg / mLDOX濃度200µLを3時間処理し、イメージングのために細胞を4％パラホルムアルデヒドで固定しました。核をDAPIで染色し、細胞を共焦点レーザー走査顕微鏡（Carl Zeiss、LSM-700）で観察しました。ここでは、560 nmでのDOXの最大発光を利用して、共焦点顕微鏡で赤色を与える内部移行を追跡できます。同じプロトコルを使用して、FePO ₄ をインキュベートすることにより、時間依存性の内在化アッセイを実施しました。 -DOX NPと無料DOXをそれぞれ0.5時間、1時間、3時間。

RNAの安定性と発現

トルラ酵母RNA（Sigma-Aldrich）を1 mg / mlで滅菌脱イオン水に溶解し、2 µgのアリコートを20 ug / mLのナノ粒子（CNT、Cu、Ag、ZnONPまたはFePO ₄ ）37℃でインキュベートし、以前に報告したようにRNAアガロースゲル電気泳動で経時的にアッセイしました[42、52]。図5に示す時点は一晩です。同様に、ナノ粒子を含む/含まないRNAを10％FBS / DMEMに曝露し、上記のようにRAGEで再度アッセイしました。 mRNAfLucはTrilinkBiotechnologiesから入手し、2 µlをメチニン、システイン、ロイシン（ProMega Corp）を添加したウサギ網状組織で、20 µg / mlのナノ粒子の有無にかかわらず、30度で1.5時間インキュベートし、標準的なルシフェリン試薬を添加し、発光測定を行いました。標準的な条件下でBiotekSynergyH1プレートリーダーで撮影。

統計分析

すべてのデータは、少なくとも3つの独立した複製を表し、平均±s.dとして表されます。いつでも可能なとき。細胞生存率データには6つの複製が含まれています。

データと資料の可用性

現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて対応する著者から入手できます。