アロワナの魚の性別を測定するためのアクリルゴールドナノコンポジットからの高感度電気化学DNAバイオセンサー

背景

アジアアロワナ（ Scleropages formoss ）、淡水魚[1]は、マレーシア、シンガポール、タイ、インドネシア、カンボジア、ベトナム、ラオス、ミャンマー、フィリピンなどの東南アジア地域の田園地帯に広く分布しています。さらに、アロワナの魚はオーストラリアとニューギニアでも見られます[1,2,3,4]。ドラゴンフィッシュ、アジアアロワナ、ケリサ、バジュランタイとして広く知られています[5、6]。ジュラ紀の原始的な魚種として今も生き残っています[7、8]。中国とアジアの人々は、他の多くの文化とともに、それを幸運と幸福の象徴と見なしていました[6]。一般的に、アロワナは成熟した年齢で体重が約7 kg、体長が1mです[9]。この観賞魚は魅力的な色と形態を持っており、体のサイズが比較的長い、胸びれが大きい、背びれと肛門のひれが体のはるか後ろにあるなど、独特の身体的特徴によって識別できます。アジアアロワナ種の中で密接に関連する淡水魚の3つの主要な色の種類、すなわち金色、赤、緑があります。東南アジアのさまざまな地域に由来する他のいくつかの異なる種もあり、多くの河川系に地域的です[8]。

その高い人気と装飾目的での大きな需要のために、アジアアロワナは利益を求めて激しく狩られており[6]、その結果、人口は急速に減少しています。アジアアロワナは、装飾産業での高い需要、自然人口の乱獲、生活環境の変化による自然生息地の希少性を考慮して、1980年以来、国際取引条約により絶滅の危機に瀕している絶滅危惧種に分類されています。絶滅のおそれのある野生動植物の種（CITES）に掲載されており、最近、2006年のIUCNレッドリスト[1、3、8、10、11]によって絶滅危惧種に指定されています。ただし、この絶滅危惧種の商業取引は、インドネシア、シンガポール、マレーシアなどの特定の国を除いて、CITESで禁止されています。 [2、3、12]。アジアには多くのCITES登録耕運機があり、アロワナ魚の養殖と取引を積極的に行っています[2、12]。このアジアの淡水魚は地理的に孤立した系統で構成されており、東南アジアの河川全体のさまざまな地理的分布に基づいた、さまざまな色の品種を持つ種の唯一のメンバーです。種の分布は現在、はるかに広範囲に及んでおり、アフリカのナイル川、南アメリカのアマゾン川、オーストラリア、ニューギニアにまで及んでいます[1、4、8]。

アジアアロワナのさまざまな色の中で、赤と金色のアロワナは、黒、緑、銀、その他の色の品種と比較して、孵化場業界で最も高価で人気のある装飾用ペットです[1、5、10、13]。アジアアロワナの卵泥棒現象は、他の魚種と比較して非定型です。一般に、アロワナは3〜4歳で成熟し、非常に大きなサイズ（直径約1 cm）の卵を数個（30〜100）[14、15]産むだけです[16]。興味深いことに、受精卵と幼虫は保護され、オスのアロワナの口の中で育ち、高い親の世話をします。性的二形の特徴的な表現型器官がないため、赤ちゃんアロワナの視覚的観察に基づいて性別を特定することは困難です[14、15]。子孫が彼の口から収穫されているので、両親の1人（男性であると推定される）だけが識別できます。他の親は、多くの潜在的な親の中から特定することはできません[16]。

通常、愛好家は、水族館での装飾目的や養魚場での養殖のために、赤ちゃんアロワナの魚を飼っています。しかし、性別や色の多様性を区別するための支援技術が不足しているため、すべての種類の幼魚のアロワナは同じ価格で販売されています。現在まで、アロワナの幼魚の性別と色を特定するための確立された方法は発表されていません。代わりに、アロワナの遺伝的構造と伝記に基づくDNA分析を使用して、幼い頃の性別と色を特定するために、何百もの研究が行われてきました。体の大きさと虫歯の推定に基づく従来の方法は、性別と色の識別のために、赤ちゃんアロワナの生後約3か月でしか行うことができません[17]。しかし、この従来の目視検査方法は時間がかかり、しばしば不正確な結果をもたらします。一方、DNAシーケンシングに基づく広く使用されている標準的な方法、つまりポリメラーゼ連鎖反応（PCR）とゲル電気泳動は、労力、時間、およびリソースを必要とします。アロワナの性別検出の検出には、発明的な問題解決（ARIZ）法の代替アルゴリズムが以前に採用されていました[18]。 ARIZは、性別検出の代替ツールであり、9つの異なる部分と合計40の複雑なステップが含まれています。習得と実践には非常に長い時間がかかり、操作には経験豊富な人員が必要です。たとえば、さまざまなエンジニアリングシステムでのARIZの適用が採用されていますが、ほとんどの場合、ARIZのすべての要件とプロセスを網羅していませんでした。

この研究では、N-アクリルオキシスクシンイミド（NAS）部分を介してスクシンイミド官能基で修飾されたアクリルポリマーミクロスフェアを、DNAプローブ固定化のマトリックスとして使用しました。 Chen and Chiu2000およびChaixetal。によって以前に報告されたように。 2003 [19、20]、スクシンイミド官能基はアミン官能基と反応して共有結合を形成することができます。 DNAマイクロバイオセンサーアプリケーション用のアクリルミクロスフェアへのNAS機能の組み込みは、球を合成し、短時間（数分）で光重合を使用するワンステップ手順で機能化できる簡単な調製方法の利点を提供します。さらに、ミクロスフェアはサイズが小さいという利点があり、DNAプローブの固定化に大きな表面積を提供するため、反応物や生成物の拡散に対する障壁が減少します。これにより、応答時間の短縮と線形応答範囲の拡大という点でバイオセンサーのパフォーマンスを向上させることができます。これは、ここで報告する作業で実証されます。

本研究では、高感度、シンプル、製造が容易、低コストの電気化学的DNAバイオセンサー法を提案し、アロワナの幼魚の性別を高精度に決定します。 DNAバイオセンサーは、コロイド金ナノ粒子（AuNPs）で修飾されたカーボンスクリーンプリント電極（SPE）と、NAS官能基で官能化されたポリアクリレートミクロスフェアから構築されました。 AuNPは、静電相互作用を介してカーボンSPE表面に固定化され、電極の導電性を高め、電子移動を促進する上で重要な役割を果たしました。一方、アクリルミクロスフェア（AcMP）は、物理吸着を介してAuNP修飾SPEに直接堆積しました。次に、アロワナのアミノ化DNAプローブを、AcMPの露出したスクシンイミド基で固定化されたAcMP-AuNP複合材料に共有結合させました。プローブ-ターゲットハイブリダイゼーションは、差動パルスボルタンメトリー（DPV）を介してアントラキノンレドックスラベルで検出されました。小さくて均一なサイズのAcMPを組み込むことで、大きなDNA負荷容量を維持し、電気化学的アロワナDNAバイオセンサーの感度と検出限界を高めることができました。

メソッド

装置と電極

すべての電気化学的測定は、Autolab PGSTAT 12ポテンシオスタット/ガルバノスタット（メトローム）を使用して、-1.0 V〜-0.1Vの電位窓内で0.02Vステップ電位でDPVを使用して実行されました。作用電極。棒状の白金（Pt）電極と3.0MのKCl内部溶液で満たされたAg / AgCl電極を、それぞれ補助電極と参照電極として使用しました。 ElmaS30H超音波処理槽を使用して均一な溶液を調製しました。

化学薬品

2–2-ジメトキシ-2-フェニルアセトフェノン（DMPP）はFlukaから購入しました。 1,6-ヘキサンジオールジアクリレート（HDDA）、n-ブチルアクリレート（nBA）、およびAu（III）クロリド三水和物はSigma-Aldrichから供給されました。コロイド状AuNPは、Grabar etal。によって報告された方法に従って合成されました。 （1995）。ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）とNaClはSystermから入手しました。 NASとアントラキノン-2-スルホン酸一水和物ナトリウム塩（AQMS）はAcrosから調達しました。 Milli-Q水（18mΩ）を使用して、すべての化学的および生物学的溶液を調製しました。 DNAプローブのストック溶液を0.05MのK-リン酸緩衝液（pH 7.0）で希釈し、相補的DNA（cDNA）および非相補的（ncDNA）溶液を、1.0mMを含むpH7.0の0.05MのNa-リン酸緩衝液で調製しました。 AQMS。 K-リン酸緩衝液は、スクシンイミド官能化アクリル材料への最大のDNAプローブ固定化を促進しますが、Na-リン酸緩衝液は、DNAハイブリダイゼーション反応に最適な条件を提供します[21、22]。

アクリルミクロスフェアの合成

AcMPは、わずかな変更を加えて前述の方法に従って準備されました[22]。簡単に説明すると、450μLのHDDA、0.01 gのSDS、0.1 gのDMPP、7 mLのnBAモノマー、および6mgのNASの混合物を15mLのMilli-Q水に溶解し、室温（25°C）で超音波処理しました。 ）10分間。その後、エマルジョン溶液を、N ₂ の連続流下で600秒間UV光で光硬化させた。 ガス。次に、得られたポリ（nBA-NAS）ミクロスフェアを、4000 rpmで30分間遠心分離し、続いてK-リン酸緩衝液（0.05 M、pH 7.0）で3回洗浄して収集し、周囲温度で乾燥させました。

アクリルミクロスフェアを使用したDNAバイオセンサーの製造

表面改質の前に、カーボンSPEをDI水で完全にすすぎ、3 mg / mLのアクリルポリマーミクロスフェアでドロップコートし、周囲条件で風乾させた後、5 mg / mLのドロップキャストを行いました。コロイド状AuNP。 AcMPsおよびAuNPsによる修飾前後のカーボンSPEの電気化学的特性をCV法で調べた。図1は、電気化学的DNAバイオセンサーの3段階の製造と1段階のアロワナcDNA検出で構成される方法を示しています。約10μLのコロイド状AuNP（1 mg /300μL）を最初にカーボンSPEに堆積させ、25°Cで風乾しました。 AcMP（1 mg）をエタノール（100μL）に容易に懸濁して安定した分散液を形成したため、10μLのAcMP懸濁液をAuNP修飾SPEにドロップコーティングしました。次に、AcMP-AuNP修飾カーボンSPEを300μLの5μMアロワナDNAプローブ溶液に6時間浸し、DNA固定化プロセスを実行し、K-リン酸緩衝液（0.05 M、pH 7.0）で3回注意深く洗浄しました。バインドされていないキャプチャプローブを削除します。固定化されたDNAプローブを2MのNaClと1mMのAQMSを含む300μLのターゲットDNA溶液に浸し、1時間以内にDNAハイブリダイゼーションとインターカレーション反応を起こさせた後、Milli-Q水とリン酸Naで順次リンスしました。ハイブリダイズしていないDNA断片の除去およびAQMS電気化学標識の特異的結合のためのバッファー（0.05 M、pH 7.0）。すべてのDPV測定は、pH7.0および室温の0.05Mリン酸緩衝液4.5mLで実施しました。

AcMP-AuNP修飾電極に基づく電気化学的アロワナDNAバイオセンサーの製造手順

電気化学的アロワナDNAバイオセンサーの最適化

それぞれのAcMP、AuNP、およびAcMP-AuNP複合材料で修飾されたDNA電極は、1mMのAQMSおよび2MのNaClの存在下でのDPV電気分析法によるcDNA（5μM）およびncDNA（5μM）テストで使用されました。 Ag / AgCl参照電極に対する0.5V / sのスキャンレート。 DNAプローブの固定化期間は、9ユニットのAcMP-AuNP修飾SPEを300μLの5μMアロワナDNAプローブ溶液に1、2、3、5、6、7、8、12、および18時間別々に浸すことによって決定しました。 1mMのアントラキノンレドックスインターカレーターと2MのNaClを含むDNAハイブリダイゼーションバッファー（pH7.0の0.05MのNa-リン酸バッファー）中の5μMのcDNAとの反応。 DNAハイブリダイゼーション時間は、2MのNaClと1mMのAQMSの存在下で300μLの5μMcDNA溶液に10〜100分間DNA電極を浸すことによって調査されました。 DNAハイブリダイゼーション時間に対する温度の影響は、DPV技術を使用して、測定バッファーで5〜90分間、4、25、40、および50°CでアロワナDNAバイオセンサー応答を測定することによって行われました。 pH効果の研究のために、アロワナDNAバイオセンサーを2MのNaClと1mMのAQMSでpH5.5とpH8.0の間で調整した0.05Mのリン酸ナトリウム緩衝液から調製した5μMのcDNA溶液に浸し、DPV測定を行いました。さまざまな正に帯電したイオン（つまり、Ca ²⁺ ）の効果 、Na ⁺ 、K ⁺ 、およびFe ³⁺ イオン）電気化学的アロワナDNAバイオセンサー応答は、CaCl ₂ を追加することによって実行されました。 、NaCl、KCl、およびFeCl ₃ DNAハイブリダイゼーション反応およびDPV測定の前に、0.05 Mのリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.0）に入れます。ハイブリダイゼーションバッファーのイオン強度は、Na-リン酸バッファーとNaClの濃度をそれぞれ0.002〜0.1000 Mから1.52〜5.50Mまで変化させることで最適化されました。次に、アロワナDNAバイオセンサーの線形検量線を、1.0×10 ^-18 の一連のcDNA濃度の定量測定によって確立しました。 〜2.0×10 ⁻² DPV法によるμM。すべての実験は3回行った。

DNA抽出とアロワナDNA分析

合計15のアロワナ魚組織サンプルが、マレーシア水産局の水産研究所（FRI）から提供されました。すべての魚の組織サンプルは、4°Cの冷却装置で70％エタノールに保存され、実験室に送られました。魚の組織サンプルをMilli-Q水で洗浄し、小片に切断し、周囲条件で乾燥させた後、-20°Cの冷凍庫に保管しました。次に、各組織サンプル（各35〜40 mg）からのアロワナDNAを、QIAquick PCR Purificationキット（マンチェスター、英国）を使用して製造元のプロトコルに従って個別に抽出し、使用しないときは-20°Cで保存しました。次に、Bio-Rad PCRサーマルサイクラー（PTC-100、Hercules、USA）を使用して、ゲノムDNAフラグメントのPCR増幅を行いました。次に、PCR産物のDNA断片を1.5％アガロースゲル電気泳動で分離しました。アロワナDNA抽出物は、性別を決定するために電気化学的DNAバイオセンサーによっても分析されました。得られたDPV応答は、アロワナDNAの存在なしで得られたベースライン電流と比較されました。 t テストは、4自由度と95％信頼水準でのDNAバイオセンサー応答とベースライン電流の間の有意差を決定するために適用されました。ベースライン電流よりも有意に高い値で得られたDNAバイオセンサー応答は、雄のアロワナ魚が検出されたことを示し、その逆も同様でした。

結果と考察

合成されたままのAcMPは、走査型電子顕微鏡（SEM、LEO 1450VP）で観察されました（図2）。光重合から調製されたアクリルマイクロプセアのサイズ分布を図3に示します。

アクリルポリマーミクロスフェアのSEM画像

光重合から調製されたアクリルマイクロファイバーのサイズ分布

K ₃ の存在下でのAcMPs-AuNPsを含むカーボンSPEの異なるスキャンレートの影響 Fe（CN） ₆ は、スキャン速度が0.05から0.30 V / sに増加するにつれて、酸化および還元のピーク電流が増加することを示しました（図4）。したがって、電極表面での電子移動プロセスは可逆的であると予想されます[22、23、24、25]。

1.0 mM K ₃ のサイクリックボルタモグラム Fe（CN） ₆ 電極表面にAcMP-AuNP材料を含む修飾カーボンSPEの場合、さまざまなスキャン速度（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、および0.30 V / s）のpH7.0の0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液で

Randles–Sevcikの式に基づく

相関係数（ R ）を使用して、レドックスピーク電流とスキャンレートの平方根の間に良好な線形性が見つかりました。 ² ）式で示されるように、50〜300 mV / sの範囲内で0.996。 2および図5a。

酸化ピーク電流（ip /μA）対スキャンレートの平方根（（mV / s） ^1/2 のプロット ）（ a ）および酸化ピーク電流の対数（ip /μA）対スキャン速度の対数（log（mV / s））のプロット（ b ）

これは、修飾電極の表面での反応が拡散律速反応であったことを示しています[22、23、24、25]。

さらに、図5bに基づいて、酸化電流の対数値をスキャン速度の対数値に対してプロットすると、拡散律速プロセスの理論値0.50に近い0.65の傾きの直線が得られました。 。したがって、この研究は、修飾されたSPEの表面での反応がほとんど拡散律速であることを示しています。

高速で可逆的な1電子移動プロセスの理想的なケースでは、298KでΔEp=0.09 Vです。ただし、スキャンレートとともに増加するピーク電位シフトは、0.059 Vを超える大きなピーク電位分離を示しました（図4 ）。これは、おそらく電極表面を覆うAcMP材料の存在によって生じる抵抗のために、電極表面での電子移動プロセスが遅いことを意味します[22、25、26]。

図6は、AcMP、AuNP、およびAcMP-AuNPで修飾されたカーボンSPEに基づくアロワナDNAバイオセンサーのDPV応答を示しています。実験（a）と（c）の間で観察された有意なDPV電流の違いは、アロワナDNAプローブがAcMPのスクシンイミド官能基とアミノ化DNAプローブのアミン官能基の間の強力な共有結合を介してAcMPにうまく移植され、固定化されたことを示していますarowana DNAプローブは、そのcDNAに対してのみ選択的でした[19、20]。 AuNPは、挿入されたAQMSから製造された電極表面への電子伝導を支援する役割を果たしました。複合材料（f）、金ナノ粒子（e）、および金ナノ粒子とAcMP複合材料（d）にAuNPを含めないと、電流応答はほとんど観察されません。実験（b）で得られた低いDPV電流は、ncDNAでDNAハイブリダイゼーション反応が起こらなかったためであり、これは電極表面でのAQMS酸化還元指示薬の特異的吸収がないことも示しています[27、28]。

cDNAとのハイブリダイゼーション時のAcMP-AuNPベースのDNA電極のDPVシグナル（ a ）および非相補的DNA（ b ）、AcMPのDPV応答（ f ）およびAuNPで変更されたSPE（ e ）、およびAcMP-AuNP複合修飾SPE、およびAcMP-AuNP複合修飾プローブDNA SPEに基づくDNAバイオセンサーの応答（ c ）Ag / AgCl参照電極に対して0.5V / sのスキャン速度で1mMAQMSの存在下でcDNAと反応する前

DNAプローブ固定化期間の場合、図7aは、DNAプローブ固定化時間の最初の1〜3時間でゆっくりと増加するDNAバイオセンサー応答を示し、DNAプローブ固定化期間の3〜6時間でDNAバイオセンサー応答の急激な増加が見られます。 。これは、AcMP-AuNP修飾電極に付着する大量のDNAプローブを促進するために、より長い固定時間が必要だったためです。 DNAプローブの固定化時間をさらに延長すると、固定化されたAcMPの結合部位がDNAプローブと完全に結合したため、DNAバイオセンサー応答に目立った変化は認められませんでした。アロワナDNAバイオセンサーの応答は、DNAハイブリダイゼーション時間にも依存します。図7bに示されているバイオセンサー応答プロファイルは、DNAハイブリダイゼーション期間が10分から60分までのDPV電流応答傾向の増加を示しており、その後、電流応答はほぼプラトーになります。この段階で、電極に固定化されたDNAプローブはcDNAと完全にハイブリダイズしています[29]。

DNAプローブ固定時間の影響（ a ）およびDNAハイブリダイゼーション時間（ b ）2Mイオン強度で1mMAQMSの存在下で5μMDNAプローブとcDNAを使用したアロワナDNAバイオセンサー応答について

また、作製したアロワナDNAバイオセンサーのDNAハイブリダイズ時間は温度に依存し、大きな利点として、室温で30分以内に最大電流応答が得られたことにも注目してください（図8）。低温、すなわち4℃では、低温がDNAハイブリダイゼーション反応速度を遅くしたため、完全なDNAハイブリダイゼーション反応には長い時間が必要でした。固定化されたDNAプローブとcDNAの間で発生したより高いDNAハイブリダイゼーション反応速度が高温で二本鎖DNAを形成するため、25°Cを超える温度でより速いDNAハイブリダイゼーション時間を達成できます。しかし、高温はDNAの二重らせん構造を永久に変形させる可能性があり、温度を最適値に再調整した後でもDNA分子の再生は不可能です[28、30]。

アロワナDNAバイオセンサーのDNAハイブリダイゼーション時間に対する温度の影響。 DPV応答は、0.05 M K-リン酸緩衝液（pH 7.0）で、4、25、40、および50°Cで5〜90分の実験期間で測定されました。

アロワナDNAバイオセンサー応答の最適化の一環として、DNAハイブリダイゼーション反応に対する溶液のpHの影響を調査しました。 DNAバイオセンサーは、DNAのホスホジエステル骨格のプロトン化により、pH5.5とpH6.5の間でごくわずかな電流変化を示しました。これにより、水性環境でのDNA分子の溶解度が低下しました（図9）。 DNAハイブリダイゼーション培地のpHがさらに上昇すると、アロワナDNAバイオセンサー応答はpH 7.0で急激に上昇し、その後、より高いpHでのDNAの不可逆的変性により、pH環境が塩基性状態に変化するにつれて、DPV電流の急激な低下が認識されました。範囲[23、24、31、32、33]。最大のDPV応答は中性pHで取得されたため、アロワナDNAバイオセンサー応答の次の電気化学的評価は0.05Mのリン酸ナトリウム緩衝液を使用してpH7.0に維持されました。

pH5.5とpH8.0の間のAcMP-AuNP複合修飾カーボンSPEに基づくアロワナDNAバイオセンサーのDPV応答。 DPV測定は、0.05 M K-リン酸緩衝液（pH 7.0）、25°C、スキャン速度0.5 V / s対Ag / AgCl参照電極で実施しました

DNAハイブリダイゼーション反応に対する陽イオンの原子価の効果は、塩の異なる陽イオンを使用して実行されました。 Ca ²⁺ 、Na ⁺ 、K ⁺ 、およびFe ³⁺ DNAハイブリダイゼーションバッファー中のイオン。正に帯電したイオンは、DNA分子の負に帯電したホスホジエステル鎖と静電的に相互作用して、固定化されたDNAプローブとターゲットDNA間の立体障害と静電反発を克服し、それによってDNAハイブリダイゼーションプロセスを促進します[34]。図10は、Na ⁺ のオーダーのカチオンの存在下でDNAハイブリダイゼーション反応が良好であったことを示しています。> K ⁺ > Fe ³⁺ > Ca ²⁺ 。 Ca ²⁺ の存在 およびFe ³⁺ イオンは、Na ⁺ と比較して、アロワナDNAバイオセンサーの電流応答に顕著な減少を引き起こすことがわかりました。 およびK ⁺ イオン。これらの現象は、DNAハイブリダイゼーションバッファー[22]での難溶性リン酸カルシウムおよびリン酸鉄（III）塩の形成に起因し、溶液のイオン含有量が減少し、DNA分子間に高い静電反発力が生じました。その結果、DNAハイブリダイゼーション率が低下し、バイオセンサーの性能が低下しました。最高のDNAバイオセンサー応答は、Na ⁺ のときに得られました。 イオンは、サイズが小さく、DNAリン酸二量体結合に対して強い親和性があるため、DNAハイブリダイゼーションリン酸緩衝液に追加されました。

Ca ²⁺ の効果 、Na ⁺ 、K ⁺ 、およびFe ³⁺ アロワナDNAバイオセンサーのDPV応答に対するDNAハイブリダイゼーションバッファー（pH7.0の0.05Mリン酸ナトリウムバッファー）中のイオン

ハイブリダイゼーションバッファーに最適なイオン強度を提供するには、NaClおよびリン酸ナトリウムバッファー（pH 7.0）の濃度も最適化する必要があります。図11bは、2M以下および2Mを超えるイオン強度では、DNA鎖間の高い静電反発力を克服できなかったことを示しています。約0.05Mのリン酸ナトリウム緩衝液（図11a）と2 MのNaClが、最大のバイオセンサー性能を備えたアロワナターゲットDNAのアッセイに最適なイオン強度を提供することがわかりました。 pH、バッファー容量、およびイオン強度の観点から最適なハイブリダイゼーションバッファー条件により、DNAハイブリダイゼーション反応を最小限の立体障害で発生させることができます[30]。

アロワナDNAバイオセンサーの応答は a として傾向があります リン酸ナトリウム緩衝液濃度と b ハイブリダイゼーションバッファーのイオン強度は、それぞれ0.002〜0.100 Mおよび1.52〜5.50Mの範囲で変化しました

次に、最適化されたDNAバイオセンサーを使用して、1.0×10 ^-12 の一連のアロワナcDNA濃度を検出しました。 および1.0×10 ⁻² μM。 DNAバイオセンサーは、1.0×10 ^-18 の広い線形応答範囲を示しました。 〜1.0×10 ⁻⁸ M（ R ² =0.99）。 1.0×10 ^-18 で得られた検出限界（LOD） Mは、LODを線形キャリブレーションスロープで割ったものに近似する応答曲線でのバイオセンサー応答の標準偏差の3倍に基づいて計算されました。マイクロメートル範囲内の均一なAcMP粒子サイズは、DNAバイオセンサーの感度と再現性に大きな影響を及ぼしました（RSD =5.6％）。固定化されたNAS機能化AcMPの大きな結合表面積により、多数のDNA分子が電極表面に共有結合することが可能になり、それにより、動的線形範囲およびアロワナDNAバイオセンサーの検出限界に関するDNAバイオセンサー分析性能が向上しました（図。12）。

アロワナDNAバイオセンサー応答曲線（ a ）および線形キャリブレーション範囲（ b ）およびDPVボルタモグラム（ c ）1.0×10 ^-18 を使用して取得 〜1.0×10 ⁻² pH7.0でのμMcDNA

DNAバイオセンサーによるアロワナの魚の性別の決定

開発された電気化学的DNAバイオセンサーは、アジアアロワナの性別を決定するための標準的なPCRベースの方法で検証されています。表2に示した結果では、どちらの方法でも、アロワナ魚の性別を決定するために同じ結果が得られました。これは、提案されたDNAバイオセンサーを使用して、アロワナの性別を簡単かつ迅速に正確に判断できることを示しています。

結論

この研究で開発された電気化学的DNAバイオセンサーは、アロワナターゲットDNAの測定において、優れた感度、広い線形応答範囲、および低い検出限界を示しました。さらに、DNAバイオセンサーはアロワナcDNAに対して良好な応答を示しました。これは、電気化学的DNAバイオセンサーを使用してアロワナDNAセグメントを正常に検出できることを意味します。開発されたアロワナDNAバイオセンサーは、アロワナの性別と色を早期に特定するための魚の養殖への応用に大きな可能性を提供するユースポイントデバイスのプロトタイプにさらに再設計できます。これは、水産養殖分野で経済的に有利です。