腫瘍の光検出および治療のための5-アミノレブリン酸-スクアレンナノアセンブリ：invitro研究

背景

医療ナノテクノロジーは、有望な新しいドラッグデリバリープラットフォームを導入しました。それらは、作用部位での制御された送達を提供しながら、薬理学的に活性な化合物の化学的安定性および薬物動態プロファイルを改善するのに役立つ生体適合性および生分解性ナノ材料から構成される[1,2,3]。しかし、これまでのところ市場に出回っているナノ粒子システムはごくわずかです。既存のナノ粒子（NP）の主な落とし穴は、主に薬物の負荷が少ないこと（通常は5％未満）と、標的部位に到達する前に薬物のかなりの部分を早期に放出する「バースト放出効果」です。これは有害な副作用を引き起こし、毒性と薬理活性の喪失につながる可能性があります[4]。

スクアレン（SQ）は、化学式C ₃₀ の線状トリテルペンです。 H ₅₀ コレステロールや他のステロイドの前駆体[5]。人体では、スクアレンは肝臓と皮膚で合成され、血液中の低密度リポタンパク質（LDL）と超低密度リポタンパク質（VLDL）によって輸送されます[6]。腫瘍治療との関連で、スクアレンは特定の化学療法剤に対して強力な増強効果を示しました[7]。スクアレンは自然界に広く存在し、安全であるため、ワクチン、さまざまな活性化合物、および遺伝子を送達するための脂質エマルジョンの調製における賦形剤として、製薬技術での用途が見出されています[6、8、9]。スクアレンは、さまざまな薬物への共有結合に適していることがわかっています。この方法で作成された高度なナノシステムには、ゲムシタビン[10,11,12]、パクリタキセル[13]、シスプラチン[14]、ドキソルビシン[15]などの化学療法剤に結合したスクアレンが組み込まれています。このアプローチは「スクアレノイル化」と呼ばれ、有効成分が共有結合しているナノコロイド系の形成を伴うプロドラッグ戦略を伴います[16、17]。スクアレンベースのナノアセンブリ（NA）は、水性媒体中での機能性成分の自己組織化によって形成され、固有の高い薬物負荷を特徴としています[18]。スクアレノイル化は、薬物の安定性を高め、難水溶性薬物の溶解性を高め、それにより、バイオアベイラビリティを改善し、体循環における薬物半減期を延長することがわかっています[14、16]。ほとんどの場合、そのような自己組織化NAは、親薬物よりも優れた薬理活性を示します[16、19]。さらに、スクアレノイル化は、治療法と画像診断法の両方を含むNAを構築する手段を提供します[20]。同様のセラノスティックNAは、MRI造影剤をスクアレノイルゲムシタビン（SQgem）ナノアセンブリに組み込むことにより、Couvreurとその同僚によって報告されています[14]。これらのタイプの多機能システムは、個別化医療のための新しい治療薬を開発する上で非常に重要である可能性があります。

癌のセラノスティクスとの関連で、小分子の5-アミノレブリン酸（5-ALA）の投与（図1）により、光線力学療法（PDT）に5-ALAが臨床的に使用されるようになりました[21、22、23]。 、光診断（PD）[24]、および脳腫瘍神経膠腫患者における蛍光ガイド下腫瘍切除[25,26,27]。セラノスティクスは、ヘムサイクルのバイパスされたフィードバック阻害の結果として、5-ALAの代謝と、癌組織内でのプロトポルフィリンIX（PpIX）の選択的蓄積によって達成されます[22]。ただし、5-ALA PDおよびPDTの有効性は、血流に見られる中性pHでの双性イオン性によって深刻に妨げられます。 5-ALAの安定性と薬物動態プロファイルを改善するためにさまざまな試みがなされてきました。 5-ALAのアミノ末端とカルボキシル末端の両方がさまざまなアプローチによって修飾されています[28]。 5-ALAのカルボキシル基のエステル化により、5-ALAメチルエステル（Metvix®）[29]が生成され、光線性角化症、基底細胞癌、急性にきびの局所治療に使用されます。 5-ALAのヘキシルエステル（5-ALA-Hex）（Hexvix®）は、膀胱がんの光診断（PD）の販売承認を取得しており[30、31]、子宮頸がんおよび重度のにきびの治療に実験的に利用されています[32 、33,34]。

NAビルディングブロック要素の化学構造。 5-ALA（ a ）、5-ALA-Hex（ b ）、スクアレン（ c ）、および5-ALA-SQ（ d ）

ただし、Gliolan™を除いて、5-ALAおよびその誘導体の臨床使用は主に局所投与に限定されています。これにより、乳がん、結腸直腸がん、肺がん、前立腺がんなど、より重要な種類のがんでの使用が制限されます。 5-ALAの使用を拡大する試みには、最近非常に有望な活性を示した5-ALAのアミノ末端修飾ホスファターゼ感受性誘導体があります[35、36]。さらに、5-ALAを高分子NA [37,38,39]またはリポソーム[40,41,42,43]を含むさまざまなナノシステムにカプセル化し、デンドリマー[44、45]または金NP [46]に結合させる試みが行われています。 、47]。これらのソリューションのいくつかは、5-ALAの安定性とその薬物動態プロファイルの改善に役立ちましたが、前述の試みのいずれも、癌ナノメディシンの分野で成功した臨床候補にはなりませんでした。

この作業の目的は、水性媒体中で自己組織化し、前提条件である5-ALAの高い薬物負荷を含む5-ALA-スクアレン（5-ALA-SQ）コンジュゲートビルディングブロック（図1d）の設計と合成でした。癌の薬理学的活動のため。 NAは、2つの異なる癌細胞株で蛍光PD機能についてテストされました。血漿リポタンパク質を利用して間接的な癌標的化を達成するスクアレンベースのNAの最近の報告と組み合わせて[48]、この5-ALAナノテクノロジーアプローチは、この研究で使用される前立腺癌などのさまざまな癌のPDおよびPDTに対する5-ALAの使用を拡大します。

結果と考察

5-ALA-SQビルディングブロック合成

効率的な収束化学戦略を使用して、スクアレンと5-ALAから5-ALA-SQビルディングブロックを合成しました（図2）。 5-ALAは最初に N でアミノ末端が保護されていました -標準条件を使用したBoc保護基。ナノアセンブリを誘発するスクアレンアルコール（ 3 ）は、文献[49]に記載されている手順に従って、4つの合成ステップでスクアレンから合成されました。 Boc-5-ALA（ 2 ）およびスクアレンアルコール（ 3 次に、EDCおよびDMAPの存在下でカップリングして、保護されたエステル誘導体（ 4 ）良好な収率で。最終的なBoc脱保護は、スクアレン足場への求電子付加を回避するために、穏やかな酸性条件下で実行する必要がありました。最終生成物を逆相HPLCで精製して、NAビルディングブロックを良好な収率で生成しました。

5-ALA-SQビルディングブロック合成。 5-ALA-SQは、5-ALAとSQからの収束合成を使用して4つの合成ステップで合成されました

5-ALA-SQナノアセンブリ

ナノ粒子（NP）による活性化合物のその作用部位への効率的な送達を達成するために、ナノ粒子のサイズ、形状、表面電荷などのパラメーターが重要な役割を果たし、体内のナノ送達システムの薬物動態を支配します。 50]。特に、粒子サイズは、体循環におけるNP半減期、マクロファージによる隔離、漏出性血管系を介した作用部位への血管外漏出など、いくつかの薬物動態学的現象を支配します[51]。ナノ粒子の形状とサイズは、血管系に見られる開窓を介して血管外遊出する能力を調節します[50、51]。サイズと形状は、アクティブなターゲティングと細胞への取り込みにも非常に重要です。NPが小さいほど、球形は表面積が小さく、非球形の大きなナノ粒子システムと比較して、接触点が非常に限られているためです[51]。

5-ALA-SQビルディングブロックの自己組織化は、水性媒体中で自発的に発生しました。 NAはナノ沈殿によって形成されました。 5-ALA-SQコンジュゲートを有機溶媒に溶解し、水に滴下しました。有機溶媒を完全に蒸発させると、NAの水溶液が得られた。 5-ALA-SQ NAは単分散であり、多分散性指数は0.12と低かった。電気泳動移動度測定では、ゼータ電位が36 mVであり、動的光散乱（DLS）により、平均サイズが70 nmのNAの単分散分布が明らかになりました（図3）。 NAサイズの範囲は、血流の循環​​を延長するための優れた可能性を提供します[50]。それにもかかわらず、5-ALA-SQ NAは、以前に報告されたSQ複合材料よりも大幅に小さく、100〜300 nmの範囲であり、超分子配列が異なることを示しています[19]。

5-ALA-SQNAの特性評価。低（ a ）および高（ b ）倍率クライオTEM画像、DLS分析（ c ）、および4°Cでの安定性（ d ）

サイズが小さいのは、SQ部分と比較して、正に帯電したアミノ基と比較的小さい5-ALA分子が原因である可能性があります。スクアレンに付着した小分子の変化は、自己組織化と化合物-スクアレンコンジュゲートのパッキングに変化をもたらし、その結果、NAの形状とサイズを変化させることが実証されています[16]。親油性鎖がこれらのNAの内部を占める一方で、5-ALAの非常に正に帯電したアミノ基がバルク水に向けられる可能性があります。ただし、正確な超分子構造はまだ解明されていません。他のスクアレンナノコンポジットと比較してサイズが大幅に小さいにもかかわらず、NAは優れた貯蔵安定性を示し、サイズとPDIは数週間にわたって一定に保たれます。

新しい5-ALA-SQNAのもう1つの重要な側面は、26％の薬物負荷を達成することです。これは、負荷の効率がはるかに低い他の報告された5-ALAナノ粒子システムと比較して高いです[37、38、41]。薬物負荷の少ないNPでは、投与量が標的組織の薬理学的に活性な濃度に達するのに十分でない可能性があるため、薬物負荷はNP送達において非常に重要です[4]。 5-ALAは1：1のモル比でスクアレン骨格に共有結合しているため、5-ALAと5-ALA-SQの分子量を考慮した簡単な計算で負荷を決定できます。

癌細胞におけるPpIX蛍光動態測定

PpIXの時間依存性形成は、PC3ヒト前立腺癌細胞および5-ALA-SQNAおよび5-ALA-HexとインキュベートしたU87MG神経膠芽腫で評価されました。図4は、24時間にわたって5-ALA-SQNAまたは5-ALA-Hexの濃度を増加させて曝露されたPC3ヒト前立腺癌細胞におけるPpIX形成を示しています。

PC3細胞におけるPpIX蓄積の速度論的蛍光測定。細胞は、5-ALA-SQ NAの濃度を上げながらインキュベートされました（ a ）または5-ALA-Hex（ b ）

濃度依存のPpIX蛍光プロファイルが5-ALA-SQNAで観察されました。 1.0および2.0mMでは、PpIX蛍光は24時間にわたって着実に増加し、低濃度で8時間のインキュベーション後にプラトーに達しました。一方、5-ALA-Hexは、以前に報告されたように、0.10〜0.30 mMの低濃度範囲でPpIXの最高の蓄積を誘発しました[35、52]。ただし、1 mMを超える濃度の5-ALA-Hexは細胞に対して毒性があり、観察される全体的な蛍光が減少し、その使用が妨げられることがわかりました[36]。

次に、PC3およびU87MGヒト神経膠芽腫癌細胞における用量依存的なPpIX蓄積を、最適なNA投与量を推定する目的で実施しました。 5-ALA-SQ NAおよび5-ALA-Hexとのインキュベーションの4時間および24時間での蛍光強度を図5に示します。非常に重要なことに、5-ALA-SQNAは両方の細胞株でPpIX産生を誘導しました。さらに、最大蛍光レベルは、両方の細胞株でALA-Hexコントロールと同等です。また、PC3細胞では、1.0および2.0mMの濃度の5-ALA-SQNAが、PpIXの最高の蓄積を誘導するのに最適であったことにも注意してください。 U87MG細胞では、短いインキュベーション時間で、異なる濃度の5-ALA-SQ NAの間に有意差はありませんでした（図5c）。 24時間後、PpIXの蓄積は、PC3細胞と同様に5-ALA-SQNAまたは5-ALA-Hexの濃度に依存することがわかりました。 NAの存在に対してより敏感な5-ALA-SQNAの高濃度での長期間のインキュベーション後に、ALA-Hexにいくらか類似したPpIX誘導の減少が見られました。

用量反応曲線。 PC3（ a ）における5-ALA-SQ NA（青）および5-ALA-Hex（赤）による濃度依存性のPpIX蓄積 、 b ）およびU87MG（ c 、 d ）4時間（左）および24時間（右）のインキュベーション後の細胞

図5は、24時間で、PpIX生成曲線がPC3セルとU87MGセルの両方で釣鐘型であることを示しています。 1mM濃度の5-ALA-SQNAはPC3細胞で最高のPpIX蓄積を誘導しましたが、U87MG細胞はより高い濃度に耐え、PpIX蛍光の増加は2 mM 5-ALA-SQNAまで見られました。一般に、5-ALA-Hexと比較した場合、おそらく癌細胞内のエステル結合切断速度が異なるため、PpIXの生合成を効率的に誘導するには、より高濃度の5-ALA-SQNAが必要でした。 5-ALA-Hexの非特異的毒性のために、1 mMを超える濃度の5-ALA-Hexを使用した場合、PpIX産生の減少が観察されました。この効果は、蛍光を発する5-ALA-SQではそれほど顕著ではありませんでした。レベルは、テストされた最高濃度（3.3 mM）と長時間のインキュベーション時間でのみ低下し始めました（図5b、d）。ただし、蛍光レベルは両方の化合物で類似しており、NAで蛍光ラグは観察されませんでした。

NAはまた、外科的切除中の神経膠芽腫のPDのために販売されている5-ALA対照に対してU87MG神経膠芽腫でアッセイされた。図6は、4時間後と24時間後のU87MG細胞の蛍光を示しています。 5-ALA-SQ NAは、臨床現場での関連性が高い5-ALAと比較して、4時間後に有意に高い蛍光を誘発しました。 24時間後、5-ALAのゆっくりとした能動的な取り込みにより、細胞内に十分な5-ALA量が得られるため、蛍光プロファイルは低濃度の5-ALAにシフトします。 NAは、最適な1.0および2.0 mMのNA濃度で5-ALAと同様の蛍光レベルを示します（図6b）。

用量反応曲線。 4時間後のU87MG細胞における濃度依存性のPpIX蓄積（ a ）および24時間（ b ）5-ALA-SQ NA（青）および5-ALA（緑）とのインキュベーション

臨床診療では、5-ALAは局所または経口投与されますが、その荷電性のため、細胞の種類に応じて、初期用量のごく一部のみがPEPT1、PEPT2、またはBETAトランスポーターなどの内因性ペプチドトランスポーターを介して標的細胞に入ります。 [40、53]。 SQgem誘導体からのNAに関する最近の研究は、細胞侵入が単一分子ビルディングブロックのアルブミン増強拡散によって支配され、細胞外タンパク質の存在に大きく依存することが見出されたことを示しています[54、55]。さらに、最近報告した遠赤色蛍光NAも急速な内在化を示し、5-ALA-SQ蛍光動態実験と用量反応曲線は、単一分子ビルディングブロック内在化とその後の効率的な代謝を裏付けて蛍光PpIXを生成します。

結論

このinvitroの概念実証研究では、収束化学戦略を使用して、スクアレンと5-ALAから5-ALA-SQビルディングブロックを合成しました。 5-ALA-SQ NAは、水中での自発的なナノ沈殿によって調製されました。 NAは単分散で安定しており、平均サイズは70 nm、多分散度指数は0.12、正のゼータ電位は36 mV、高、26％の5-ALA負荷でした。 PpIX産生は、経時的な蛍光増加を測定し、5-ALAおよび5-ALA-Hexと比較することにより、2つの癌細胞株でinvitroで評価されました。結果は、SQ-ALANAがPC3およびU87MG癌細胞タイプでPpIX産生を誘導するのに非常に効率的であることを示しました。それらは、invitroでの4時間および24時間のインキュベーション時間での高濃度での蛍光誘導において5-ALA-Hexよりも優れています。ただし、5-ALAと比較して、それらはより短いインキュベーション時間で優れた蛍光誘導を示します。これらの発見の範囲内で、5-ALA-SQ NAは、5-ALAの薬物動態学的欠点を克服するための魅力的なナノテクノロジーソリューションを提示すると結論付けることができます。さらに、in vivo実験では、腫瘍の蛍光PDおよびPDT療法のための5-ALAの全身送達の可能性を評価します。

メソッド/実験

試薬は、商業的供給業者であるSigma-Aldrich（スイス、バックス）およびAcros Organics（スイス、バーゼル）から購入し、さらに精製することなく使用しました。重水素化NMR溶媒は、Cambridge Isotope Laboratories（Tewksbury、USA）から入手しました。テトラヒドロフラン（THF）およびジクロロメタン（CH ₂ Cl ₂ ）は、無水エンジニアリングアルミナカラムベースの乾燥システムから得られました。使用した他のすべての溶媒はHPLCグレードでした。 N、N-ジメチルホルムアミド（DMF）、メタノール（CH ₃ OH）、ジエチルエーテル（Et ₂ O）およびアセトンはSigma-Aldrich（Buchs、スイス）から購入しました。酢酸エチル（AcOEt）はBiosolve（Dieuze、France）から購入しました。アセトニトリル（CH ₃ CN）は、Carlo Erba Reagents（Balerna、Switzerland）から提供されました。ヘキサン≥95％のn-ヘキサンはFisher Chemical（バーゼル、スイス）から購入しました。調製に使用した水は、Milli-Qラボ用水システム（Millipore、フランス、モルスハイム）によって脱イオン化されました。化学反応は、無水条件を確保するために、アルゴンの陽圧を備えた標準的なシリンジセプタムを使用して実行されました。

薄層クロマトグラフィー（TLC）は、適切な移動相を備えたアルミニウムで裏打ちされたシリカプレート（Merck-Keiselgel 60 F254）を使用して実行し、UV蛍光ランプ（254および366 nm）を使用して視覚化するか、ニンヒドリン、20％硫酸で展開しました。酸、またはリンモリブデン酸（PMA）。フラッシュクロマトグラフィーは、Interchim（Montlucon、France）の自動PuriFlash®4100マシンで、PDA検出器（200〜800 nm）と自動フラクションコレクターを備えたInterchimシリカカラムpuriFlash®HP30μmを使用して実行しました。溶出プロファイルは、FlashInterchimソフトウェアバージョン5.0xを使用して監視されました。セミ分取HPLCカラムは、Waters Symmetry300TM-5μm（19×150 mm）、C8カラム（Baden-Dättwil、スイス）で実施しました。分析UPLCは、Waters PDA検出器（Baden-Dättwil、スイス）を備えた水システムに取り付けられたMacherey-Nagel EC50 / 2 NucleodurGravity1.8μmカラム（50×2.1mm）を使用して実施しました。バッファーA =CH ₃ CN + 0.1％ギ酸）およびバッファーB =H ₂ O + 0.1％ギ酸。流量=25°Cで400.0μL/分。 ¹ Hと ¹³ C NMRスペクトルは、Varian Gemini 300 MHz、Varian Innova 500 MHz、またはBruker Avance III Cryo 600 MHz分光計で298Kで記録されました。化学シフト（δ）は百万分率（ppm）で示され、結合定数（J）はヘルツ（Hz）。 sは一重項、dは二重項、ddは二重項の二重項、tは三重項、qは四重項、mは多重項です。残留溶媒ピークは、プロトンおよび炭素の化学シフトの内部参照として使用されました。 NMRスペクトルは、Mnovaバージョン10.0.2ソフトウェアパッケージで処理されました。低分解能質量分析（LRMS）は、ESI（ポジティブモード）のHTS PAL-LC10A – API150Ex機器で実行されました。高分解能質量分析（HRMS）は、ESI（ポジティブモード）のQSTAR Pulsar（AB / MDS Sciex）機器で実行されました。化学構造は、ChemBioDraw Ultraバージョン14.0.0.117ソフトウェアパッケージを使用して、IUPAC命名法に従って描画および命名されました。 pHは、Metrohmバッファーで校正されたスピアヘッド電極（Zofingue、スイス）を使用してMetrohm 691pHメーターで測定されました。統計分析は、GraphPad Prism 6、2016、（GraphPad Software）ソフトウェアを使用して実行されました。 P 値<0.05は統計的に有意であると見なされました。

SQ-ALAビルディングブロックの合成

5-（tert-ブトキシカルボニルアミノ）-4-オキソペンタン酸（2）

Boc-5-ALAは公開された手順に従って合成されました。分光データは文献[56]と同じです。 ¹ H NMR（600 MHz、DMSO-d6）δ12.12（s、1H）、7.06（t、J =5.9 Hz、1H）、3.76（d、J =5.9 Hz、2H）、2.61（t、J =6.6 Hz 、2H）、2.40（t、J =6.5 Hz、2H）、1.38（s、9H）。 ¹³ C NMR（151 MHz、DMSO）δ206.62、174.07、156.21、78.54、49.97、40.38、40.24、40.11、39.97、39.83、39.69、39.55、34.22、28.64。 [M + H] ⁺ 232.1、232.7が見つかりました。

（4E、8E、12E、16E）-4,8,13,17,21-ペンタメチルドコサ-4,8 、12,16,20-ペンタエン-1-オール（3）

スクワレンアルコール 3 報告された手順[49]に従って、スクアレンから4つの合成ステップで23.7％の収率で無色の油として合成されました。 ¹ H NMR（300 MHz、CDCl ₃ ）δ5.17-5.06（m、5H、CH）、3.62（q、 J =6.3 Hz、2H、CH ₂ -OH）、2.17 – 1.92（m、18H、CH ₂ ）、1.67（s、3H、CH ₃ ）、1.59（m、17 H、CH ₃ およびCH ₂ ）。 ¹³ C NMR（75 MHz、CDCl ₃ ）δ135.35、135.17、135.14、134.81、131.49、125.05、124.64、124.60、124.47、63.07、39.98、39.95、39.89、36.24、30.92、28.48、26.98、26.88、26.78、25.94、17.92、16.28、16.23、16.08。 LRMS（ESI）：[M + NH ₄ に対して計算されたm / z ] ⁺ 404.4、404.8が見つかりました。

（4E、8E、12E、16E）-4,8,13,17,21-ペンタメチルドコサ-4,8 、12,16,20-ペンタエン-1-イル5-（（tert-ブトキシカルボニル）アミノ）-4-オキソペンタノエート（4）

スクワレンアルコール（ 3 ）（100 mg、0.26 mmol）、EDC（74 mg、0.38 mmol）、DMAP（94 mg、0.78 mmol）、5-（tert-ブトキシカルボニルアミノ）-4-オキソペンタン酸（2）（77 mg、0.34 mmol） DCM（15 mL）に溶解しました。周囲温度で一晩撹拌した後、溶媒を減圧下で蒸発させ、粗生成物を、ＤＣＭ ／酢酸エチル（ＥＡ）勾配を使用するフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、無色の油（１０８ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ、７０％）を得た。 ¹ H NMR（300 MHz、CDCl ₃ ）δ5.31– 5.20（br s、1H）、5.13 – 5.07（m、5H）、4.09 – 3.95（m、4H）、2.75 – 2.53（m、4H）、2.02 – 1.95（m、20H）、1.64（ s、3H）、1.63 – 1.50（m、19H）、1.41（s、9H）。 ¹³ C NMR（75 MHz、CDCl3）δ204.46、172.65、135.30、135.16、135.09、133.75、131.43、125.34、124.60、124.57、124.48、124.45、64.81、50.53、39.96、39.93、39.87、35.92、34.56、28.52、28.47 、28.43、28.24、28.02、26.97、26.86、25.92、23.11、17.90、16.25、16.21、16.06。 LRMS（ESI）：[M + NH ₄ に対して計算されたm / z ] ⁺ 617.5、617.8が見つかりました。

5-アミノのトリフルオロ酢酸塩-（（（4E、8E、12E、16E）-4,8,13 、17,21-ペンタメチルドコサ-4,8,12,16,20-ペンタエン-1-イル）オキシ）-4-オキソペンタノエート（5）

化合物 4 （34 mg、57 mmol）をDCM（2.0 mL）に溶解しました。トリフルオロ酢酸（TFA）（200μL）を加え、反応混合物を周囲温度で撹拌しました。 10分後、溶媒を低温で真空蒸発させ、EA（3×10 mL）との共蒸発によって微量のTFAを除去しました。粗生成物を、完全なH ₂ を使用するRP-HPLCによって精製した。 O / AcN（0.025％TFA）グラジエントにより、無色の油（25 mg、74％）が得られます。 ％）。 ¹ H NMR（300 MHz、CDCl ₃ ）δ5.31– 5.20（br s、1H）、5.13 – 5.07（m、5H）、4.09 – 3.95（m、4H）、2.75 – 2.53（m、4H）、2.02 – 1.95（m、20H）、1.64（ s、3H）、1.63 – 1.50（m、19H）。 LRMS（ESI）：[M + H] ⁺ に対して計算されたm / z 500.4、500.6が見つかりました。

ナノアセンブリの準備

NAは、他の場所で詳細に説明されているナノ沈殿によって調製されました[20]。簡単に言うと、ビルディングブロック 5 （1.2 mg、2.0μmol）を50/50 V に溶解しました / V アセトン/エタノールの混合物（500μL）。次に、マイクロシリンジを使用して、マグネチックスターラーで100μL/分でMilliQ水（1.25 mL）に有機相を滴下しました。攪拌しながら5分後、マグネチックスターラーを取り外し、30°Cのロータリーエバポレーターを使用して有機溶媒と過剰な水を取り除きました。ナノアセンブリの最終濃度は2.00mMでした。

5-ALA-SQNAの特性評価

5-ALA.SQ NAの5-ALA負荷は、5-ALAおよび5-ALA-SQコンジュゲートの分子量のそれぞれの寄与から次のように計算されました[19]：

NAの流体力学的直径は、ZetaSizer 7.01ソフトウェアを実行しているMalvern（Worcestershire、UK）のNANO ZS装置を使用した動的光散乱（DLS）によって測定されました。分析は、ブランド（ドイツ、ヴェルトハイム）のポリスチレン（PS）マイクロキュベットで、25°Cで173°の散乱角で4 mWのHe-Neレーザー（633 nm）を使用して実行されました。ゼータ電位（ZP）は、Malvernの折り畳まれたキャピラリーセルDTS1070でMalvernの同じNanoZS機器を使用して決定されました。サイズ分布とサイズ平均直径はデータから計算されました。 4°Cで保存されたNAの安定性は、1か月間の定期的な時点でDLSによって分析されました。

NAの形態は、TECNAI®G ² を使用した極低温透過型電子顕微鏡（cryo-TEM）によって評価されました。 2000 x 2000ピクセルの高解像度デジタルカメラTCL（Gräfelfing、ドイツ）を搭載したSphera顕微鏡（FEI、Thermo Fisher Scientific）。ガラス化した氷のサンプルは、Virtobotクライオプランジャー（FEI、Thermo Fisher Scientific）を使用して準備しました。 NA（2.0μL、2.0 mM）をQuantifoil Cu / Rh200メッシュR3.5 / 1グリッド（SPI、米国ウエストチェスター）に適用し、液体エタンを使用してガラス化しました。

細胞培養

ヒト前立腺癌細胞PC3（ATTC®CRL-1435™）およびヒト神経膠芽腫細胞U87MG（ATTC®HTB-14™）は、F-12K栄養混合物（21127-022、Thermo Fisher Scientific）または最小培地での連続継代により増殖および維持されました。エッセンシャルメディア（31095-029、Thermo Fisher Scientific）、それぞれ。細胞培地には、ウシ胎児血清（10％、CVFSVF00-01、Eurobio）、ストレプトマイシン（100μL/ mL）、およびペニシリン（100 IU / mL、15140-122、Thermo Fisher Scientific）が追加されました。細胞は、95％の空気と5％のCO _{2を含む加湿雰囲気で37°Cで培養されました。}

In VitroPpIX蛍光速度測定

ヒト前立腺癌細胞PC3（12,000細胞/ウェル）および神経膠芽腫細胞U87MG（10,000細胞/ウェル）を96ウェルプレート（透明な底の黒いプレート、3603、Corning）に播種しました。翌日、無血清培地中の5-ALA-SQ NA、5-ALA-Hex、および5-ALAの濃度を上げながら細胞を曝露しました。 PpIX蛍光は、プレートリーダー（Safire、Tecan、スイス）を使用してさまざまな時点で記録されました。励起波長は405nmに設定され、発光波長は630nmに設定されました。平均値と標準偏差プレートごとの各時点での各濃度について、参照値（処理なし）を差し引き、各細胞株についてプロットしました。