癌細胞のイメージングと光触媒不活性化のためのマイクロプラズマによる黄色蛍光カーボンナノドットの合成

はじめに

癌は依然として世界中の主要な死因です[1]。診断機能と治療機能の両方を備えた多機能ナノ粒子は、ナノ医療において有望な用途を持っています。同時画像誘導治療は、がん治療の新しい概念であり、治療効率の最適化に関して大きな期待を示しています。腫瘍のサイズと位置、光線療法の最適な時間枠、および治療効果に関する有用な情報を提供できます[2、3、4]。光線力学療法（PDT）は、その時空間選択性と非侵襲性により、多くの種類の癌やその他の疾患の治療に使用されてきました[5、6]。理想的な光増感剤は、一般に次の特性を備えています。（1）活性酸素種（ROS）の高効率生成、（2）優れた生体適合性、および（3）水溶性[7]。ただし、PDTの現在のアプリケーションは、水溶性の低さ、不安定性、および光増感剤の最適ではない励起波長によって制限されます。したがって、環境に優しく低コストの方法で、水溶性と生体適合性に優れた光増感剤代替品を生成する必要があります。

カーボンクォンタムドット（CQD）は、シンプルで環境にやさしい合成、低毒性、優れた生体適合性、優れた水溶性、光安定性など、独自の有益な特性により大きな注目を集めています[8]。 CQDは、細胞イメージング、バイオセンシング、標的化ドラッグデリバリー、およびその他の生物医学的アプリケーションでの潜在的な用途があります[9、10、11、12、13]。カーボンドットの合成には、ボトムアップアプローチとトップダウンアプローチの2つの主要なアプローチがあります。トップダウン法には、電気化学的酸化、レーザーアブレーション、化学的酸化、および超音波合成法が含まれます。ボトムアップ方式は、水熱処理、マイクロ波合成、および熱分解で構成されます[14、15、16、17]。しかし、必要とされる高温、高圧、および強酸は、常にかなりのエネルギー消費、複雑なプロセス、および環境への避けられない害をもたらします。したがって、必要に応じて、新しい環境に優しい合成方法が登場します。報告されているように、CQDは、高温条件、大量のエネルギー入力、および面倒な手順なしで、マイクロプラズマ液体法を使用してわずか数分で生成できます[18、19、20]。マイクロプラズマは、基礎研究と先端材料を含むアプリケーションの両方に独自の物理化学的環境を提供します。マイクロプラズマによって提供される化学的および電子的環境は非常に非平衡であり、エネルギーを蓄えることができます。この環境では、多数の電子、イオン、フリーラジカル、およびその他の励起イオン化活性物質が生成される可能性があります[21、22]。 o -フェニレンジアミンはカーボンナノドット合成の原料であり、マイクロプラズマ合成には使用されていません[23,24,25]。

この調査では、 o -フェニレンジアミンは、マイクロプラズマ処理によってCQDを合成するための原料として使用されました。この方法で生成されたCQDは、サイズが均一で（直径約3.2 nm）、約550nmに発光ピークを示しました。新たに合成されたCQDは、光条件下で大量のROSを生成できることを実証しました。 In vitroでは、CQDはHeLa腫瘍細胞に吸収され、420〜500nmの青色波長励起下で低毒性で黄色の光を放出する可能性があります。また、460nmの照射下でHeLa腫瘍細胞の不活化を観察しました。これらの結果は、新たに調製されたCQDが、in vivoバイオイメージング、画像誘導、または標的癌治療のための有望な材料である可能性があることを示唆しています。

結果と考察

CQDの特性評価

この研究の黄色発光CQDは、 o を使用したマイクロプラズマ法により、簡単で環境に優しい方法で作成されます。 -炭素前駆体としてのフェニレンジアミン。マイクロプラズマ処理の方法はカーボンナノドット合成に使用されることが報告されていますが、まれな相対的研究が存在します。図1Aは、CQD粒子の透過型電子顕微鏡（TEM）画像を示しています。マイクロプラズマによって生成された粒子は、平均直径3.2nmのサイクロシャープまたは楕円形でした。高解像度画像の図1A（挿入図）に示すように、CQDの格子距離は0.21 nmであり、グラファイトの（1,1,0）面に属しています。ラマンスペクトルは、無秩序誘導モードと呼ばれるDモードが1342 cm ^-1 付近にあることを示しています。 Gモードの中心は1507cm ^-1 、それぞれ、 sp の結果による ³ および sp ² -炭素の混成（図1E）。 Ｇモードと比較したＤモードの強度は、サンプル中のグラファイト微結晶のサイズに依存することが知られている。サンプルの乱れが大きいほど、ID / IGの強度比が高くなり、グラファイト微結晶が小さくなります。さらに、CQD粉末のDおよびGモードは、ID / IGの強度比が比較的高い（0.77）小さなグラファイトフレークと見なすこともできます。

CQDの特性。 A CQDのTEM画像（挿入図、高解像度TEM画像）; B CQDのサイズ分布。 C CQDのUV-vis吸収スペクトル。 D 20 nm刻みで400〜500nmの励起波長を持つCQDのFLスペクトル。 E 、 F CQDのラマンスペクトルとCQDのFTIRスペクトル

FTIRとXPSは、炭素ベースの材料の化学組成と構造を特徴付ける強力なツールです。 CQDのFTIRデータは、400〜4000 cm ^-1 の範囲で記録されました。 、図1Fに示すように。 FTIRスペクトルは、CQDが主にアミン（3052および3324 cm ^-1 ）を含むことを明らかにしました。 ）、OH（3200 cm ^-1 ）、C =O（1595 cm ^-1 ）、C–N / C–O（1200 cm ^-1 ）、C =C（1500 cm ^-1 ）およびCH（748 cm ^-1 ）官能基または化学結合[26、27]。 XPSによって決定されたCQDの表面成分は、FTIRの結果と一致していました。図2Aに示されている完全なスペクトルは、3つの典型的なピークを示しています。C1 s （285 eV）、N 1 s （400 eV）、およびO 1 s （531 eV）。

CQDのXPSスペクトル。 A CQDのフルスケールXPSスペクトル。 B C 1 s の高解像度 スペクトラム; C N 1 s の高解像度 スペクトラム; D O 1 s の高解像度 スペクトル

図2B–Dに示すように、C 1 s 分析により、 sp の存在が明らかになりました ² / sp ³ 炭素（C–C / C =C、284.8 eV）、亜硝酸炭素（C–O / C–N、285.9 eV）、およびカルボニル炭素（C =O、287.7 eV）。 N 1 s バンドは、399.3、400.3、および401.7 eVの3つのピークにデコンボリューションされました。これらは、それぞれピロリックN、グラファイトN、およびアミノNに対応します。 O 1 s バンドには、C–OとC =Oでそれぞれ531.6と533.1eVのピークが含まれていました[28、29]。重要なことに、これらの上記の官能基の存在は、CQDに好ましい溶解性を与えた。さらに、CQDの光学特性は、蛍光分光法とUV-Vis吸収を使用して調査されました。 CQDの蛍光発光スペクトルを図1Cに示します。調製されたCQDは、励起に依存する蛍光発光挙動を示します。 400〜500 nmの波長で励起すると、最大蛍光発光ピークは473〜519 nmに赤方偏移し、蛍光強度は急激に減少しました[30]。図1Dに示すように、CQDのUV-visスペクトルは、400〜490nmの波長範囲に強い吸収ピークを示しました。 CQDは、280nmと420nmに2つの特徴的な吸収ピークを示しました。これは、それぞれπ–π *（芳香族C =C）およびn–π *（カルボキシルおよび/またはC–N）遷移を示しています[31、32]。したがって、CQDのこれらの光学特性は、生物学的イメージングと光線力学的不活性化を同時に実現する可能性を提供しました。

CQDのバイオイメージングと細胞毒性

バイオイメージングおよび細胞標識のためのCQDの能力を評価するために、CQDを使用したin vitro細胞イメージングを、共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）によってHeLa細胞で調査しました。 Hela細胞を200μgmL ^-1 とインキュベートしました 6時間のCQDを実行してから、CLSM検出の準備をします。その結果、HeLa細胞は、細胞全体に均一に分布した明るい黄色の蛍光を示しました（図3A）。さらに重要なことに、200μgmL ^-1 の低いCQD濃度に注意する必要があります。 Hela細胞を黄色の蛍光で標識するのに十分であり、細胞イメージングにおけるCQDの可能性をさらに特定しました。報告されているように、カーボンナノ粒子は常に青色光領域でのみ強い発光を示しましたが、長波長の発光は通常弱いものでした。 UV励起下では、生体組織はしばしば青色の自家蛍光を示し、光損傷を受けやすく、短波長発光を伴うカーボンナノ粒子の生体イメージング分析アプリケーションを深刻に妨げます[33]。したがって、長波長発光を伴うカーボンナノ粒子の開発が広く懸念されていました。本研究では、調製したままのCQDは、400〜450nmの光の励起下で明るい黄色の蛍光を示しました。これにより、励起された黄色の蛍光により、CQDを深部腫瘍の検出に使用できるようになる可能性があります。しかし、人間の癌の画像化に実際に適用されるまでにはまだ長い道のりがあります。

CQDの適用。 A CQDで標識されたHeLa細胞のCLSMイメージング。 B CQDのinvitro細胞毒性試験; C コントロール溶液またはCQD（200μgmL ^-1 ）とインキュベートしたHeLa細胞の相対的な生存率 ）、青色光（460 nm、30 mW cm ^-2 ）にさらされます ）5分、10分、15分。 D 青色光に10分間および15分間曝露した後のHela細胞上の励起CQDのIC50（* P <0.05）

CQDを潜在的なバイオラベリング試薬として開発する場合は、発光特性に加えて、高い生体適合性と低い毒性が常に必要です。生物医学的用途の場合、材料は推奨される投与量で高度に生体適合性でなければなりません。細胞毒性を調べるために、HeLa細胞を0〜400μgmL ^-1 の範囲の最終濃度のCQDで処理しました。 24時間。図3Bに示すように、MTT（3-（4,5-ジメチルチアゾリル-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイで測定した場合、95％以上の細胞が生存し、CQDが実質的に非有毒。

これらのデータは、励起された黄色の蛍光を伴う新しく生成されたCQDは、細胞毒性が低く、生体適合性が高いことを示唆しています。これにより、生物学的イメージングの有望な見通しが容易になります。

光線力学療法の有効性

がん細胞の不活化

図3Cに示すように、生存率はCQDまたは青色光のみで処理されたHeLa細胞間で差はありませんでした。 CQDと青色光の同時処理は、光曝露の期間に応じて、Hela細胞の細胞生存率を著しく低下させました。 460 nmで15分間照射した後、CQDは顕著な抗腫瘍活性を示しました。 HeLa細胞の生存率は200μgmL ^-1 の濃度で約40％減少しました 。励起されたCQDの影響をさらに検出するために、MTTアッセイを実装して、Hela細胞に対する励起されたCQDの最大阻害濃度（IC50）の半分を評価しました。その結果、Hela細胞で励起された後のCQDのIC50は約427.5μgmL ^-1 でした。 （95％CI 366.7–498.7μg mL ^-1 ）10分間の照射後、約255.1μgmL ^-1 （95％CI 220.9–249.8μg mL ^-1 ）青色光に15分間さらした後。

これらの結果は、興奮したCQDが、フォトフリン[34]などのいくつかの臨床的抗がん剤のように腫瘍細胞を効果的に殺すことができることを示しています。

ROSによるCQDの生成

PDTの間、癌細胞は、適切な照射条件下でエンドサイトーシスされた光増感剤によって生成された細胞毒性ROSによって殺される可能性があります[35、36]。 ROSは、アポトーシスまたは壊死によって標的細胞を不活化することができ、いくつかの疾患ではPDTを介した副作用はほとんどありません[37、38、39、40]。図4Aを調べると、ROS試薬が赤色の蛍光を発していることがわかりました。これはROSの生成を示しています。さらに、ROSの赤色信号はCQDの蛍光とよく重なりました。これは、ROSの生成が腫瘍細胞によるCQDの取り込みと密接に関連していることを意味します。図4Bに示すように、対照群とレーザー照射なしの群と比較して、460 nmのレーザー照射を15分間行った実験群では、明らかなROSの生成が見られました。私たちの結果は、CQDが460 nmレーザーの照射下で細胞内​​ROSの生成を大幅に促進し、PDTへの応用に大きな可能性を秘めていることを示しています。原則として、CQDは基底状態（図4CのS0）から励起状態（図4CのSn）に励起でき、このプロセスの効率は光源の強度と吸光係数によって決まります。 。溶媒を介した緩和後、CQDは最初の一重項励起状態の最低振動レベルに留まります。励起後の急速な振動緩和により、最初の一重項励起状態（図4CのS1）から放出される光子のエネルギーは、励起光子のエネルギーよりも低くなり、結果として波長が長くなります。蛍光イメージングは​​、S0からSn、S1へのCQD遷移を利用します[41]。 CQDはHeLa腫瘍細胞によって摂取され、適切な波長源によって照射されると蛍光を発し、それによって細胞を標識することができました。 S1は、蛍光によって、または項間交差によって非蛍光三重項励起状態（図4CのT1）に戻ることによってS0状態に戻ることができます[7、42]。 T1の蛍光基は、電子移動反応で特に活性があり、スーパーオキシドフリーラジカルを生成し、その後、蛍光基の分解を引き起こします。 T1からのエネルギーが分子状酸素に移動すると、基底状態の分子状酸素よりも強力な励起一重項酸素酸化剤が生成されます。スーパーオキシドラジカルと一重項酸素、およびOHとH ₂ を含む他のROS O ₂ 、近くの生体分子と反応して光毒性を発揮し、細胞死を引き起こします。 CQDがHeLa細胞に取り込まれた後、照明によって一重項状態がシステム間を介して三重項状態に移行し、エネルギー移動のプロセスによってROSが生成され、最終的に細胞死に至りました。適切な波長源の下で、CQDは2種類のエネルギー伝達を受けます。 HeLa腫瘍細胞をマークするために蛍光が発せられ、HeLa細胞はROSによって殺されました。私たちの実験データは、暗所で新しく生成されたCQDの優れた生体適合性と、明所での腫瘍殺傷効率を明らかにしました。したがって、CQDは腫瘍細胞および組織の光増感剤として使用できます。

細胞内ROS生成。 A HeLaの蛍光画像、（a）明視野透過画像、（b）400〜450 nmの範囲で収集されたCQD蛍光画像、（c）510〜530 nmの範囲でキャプチャされたROS検出試薬の蛍光画像、および（d ）マージされた画像。 B 15分間の照射の有無にかかわらず、さまざまな濃度のCQDの細胞内ROS生成。 C 簡略化されたエネルギーレベル図は、潜在的な蛍光および細胞死のエネルギー伝達経路を示しています。 （S0、フルオロフォア分子の基底状態; S1、最初の一重項励起状態; Sn（ n > 1）; T1、最初の三重項励起状態。例、光子吸収による励起; FL、蛍光）

さらに、CQDがどのようにして腫瘍を正確に標的化し、腫瘍細胞をより効果的に殺すことができるかは、未解決の問題です。表面官能性親水性基（カルボキシル、カルボニル、エポキシ、ヒドロキシル、ヒドロキシルなど）の既存の豊富さにより、カーボンドットを腫瘍を正確に標的とする特定の抗体と結合させることができます。これには、腫瘍に特定のバイオマーカーが必要です。同時に、カーボンドットは、表面積対体積比が高いため、薬物および遺伝子送達のツールとしても機能する可能性があります[43]。優れた生体適合性、腫瘍細胞による内在化のサイズが小さいこと、表面機能部分とバイオイメージングの可能性が豊富であることを考慮すると、カーボンドット（CQDを含む）は腫瘍治療の有望な治療候補になると考えられています。ただし、ナノメディシンやバイオイメージングでのカーボンドットの応用には、依然として課題と多くの未解決の問題があります。将来的には、カーボンドット関連のナノメディシンのベンチからベッドサイドへの翻訳を促進するために、より多くの努力を払う必要があります。

結論

要約すると、 o を使用してフォトルミネッセンスCQDを合成しました -プラズマ法によるフェニレンジアミン。青色レーザーで励起された直径約3.2nmのCQDは、黄色の蛍光を発しました。ラマン、UV-vis、FTIR、およびXPSの結果は、より多くの炭素原子が sp に関与していることを示しました。 ² ハイブリダイゼーション、新しい有機基の形成。プラズマ法で合成されたCQDは、細胞イメージング実験で効果的なプローブであることが証明されており、CQDによって放出される黄色の蛍光はHeLa細胞を明確にマークすることができます。さらに、合成されたCQDは、良好な溶解性、非毒性、および高い生体適合性を示し、バイオイメージングの能力を加速する可能性があります。さらに、励起されたCQDは、ROS生成によってHela細胞を効果的に殺すことができ、in vitroでCQDの十分な光線力学的細胞毒性を明らかに示し、PDTでのアプリケーションをサポートしました。

実験方法

炭素量子ドットの合成

マイクロプラズマ処理システムは、追加ファイル1：図S1に要約されています。内径180μmの中空ステンレスパイプを高電圧直流電源（天津東文高電圧供給株式会社、天津、中国）に接続し、表面から2mm上に維持しました。解決。 Pt電極（DJS-1; Shanghai INESA Scientific Instrument Co.、Ltd.、Shanghai、China）を電源のカソードに接続し、溶液に浸しました。次に、400mgの o -フェニレンジアミン（上海、中国）を40mLの脱イオン水と20mLの o に溶解しました。 -フェニレンジアミン溶液をペトリ皿に加え、マグネチックスターラーを使用して撹拌した。マイクロプラズマ処理中、アルゴン（Ar）ガスが60 sccmの流量でパイプを流れ、DC電流は17mAに保たれました。プラズマ処理の10分後、茶色がかった黒色の生成物を、透析膜（分子量カットオフ、500 Da）を使用して2 Lの脱イオン水に対して12時間透析し、続いて0.22μmの限外濾過膜で濾過しました。最後に、純粋なCQDが凍結乾燥によって得られました。

CQDの構造、組成、および光学特性の特性評価

CQDのサイズと形態は、JEM-2100Fシステム（JEOL、東京、日本）を使用したTEMによって特徴づけられました。蛍光分光法は、Perkin Elmer LS 55発光分光計（米国マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して実施しました。 UV / Vis吸収スペクトルは、Varian Cary 50 UV-VIS分光光度計（米国カリフォルニア州パロアルト）を使用して測定しました。 FTIRスペクトルはNicolet6700分光器（Thermo Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して取得し、ラマン分光法は800 UVマイクロラマン分光計（Invia-reflex、英国）を使用して実行しました。 XPS実験は、Axis Ultra DLDシステム（島津製作所/ Kratos Analytical Ltd.、京都、日本）を使用して実施しました。

細胞培養および細胞毒性アッセイ

HeLa細胞（ATCC、マナッサス、バージニア州、米国）は、10％FBSおよび1％ペニシリン-ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で、37°C​​、加湿5％CO ₂ 雰囲気。 CQDの細胞毒性研究では、細胞をカウントし、ウェルあたり6000細胞の密度で200μLの完全培地を含む96ウェルプレートに播種しました。 24時間の培養後、細胞を0、25、50、100、200、および400μgmL ^-1 の濃度のCQDとともにインキュベートしました。 さらに24時間後、MTTアッセイを使用して細胞生存率を検出し、CQDの細胞毒性を評価しました。簡単に説明すると、これらのソリューションは100μLのMTTテストソリューション（0.5 mg mL ^-1 ）に置き換えられました。 ）、暗所のインキュベーターで4時間インキュベートします。上澄みを除去し、結晶をジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解した。最後に、各ウェルの吸光度を490nmで測定しました。光学密度は、CQDを含まないコントロールサンプルの生存率を100％と仮定することにより、細胞の生存率に関連していました。

MTTアッセイは、Hela細胞上の励起CQDのIC50を評価するためにも使用されました。簡単に説明すると、96ウェルプレートのHela細胞を、0、6.25、12.5、25、50、100、200、400、800、1600、3200、および6400μgmL ^{-1 > インキュベーター内で24時間、460 nmの光で10分間または15分間別々に処理した後、さらに24時間培養します。各ウェルの細胞生存率はMTTアッセイを使用して検出され、データはIC50評価に使用されました。}

細胞イメージング

2×10 ⁴ の濃度の細胞 mL ^-1 共焦点ディッシュ（直径=15 mm）に播種し、24時間培養し、PBSで2回洗浄して、死細胞がないことを確認しました。 CQDソリューション（200μgmL ^-1 ; pH 7）を加え、細胞を6時間インキュベートしました。続いて細胞をPBSで3回洗浄して未結合のCQDを除去し、4％パラホルムアルデヒドで固定しました。次に、CLSM（LSM510、Zeiss、ドイツ）を使用して、400〜450nmの波長で励起してサンプルを観察しました。

光線力学療法とROS測定

抗腫瘍効果を調べるために、HeLa細胞を200μgmL ^-1 とインキュベートしました。 暗所で37°Cで24時間、460 nm（30 mW cm ^-2 の光で処理されたCQD ）5、10、15分間。 24時間のインキュベーション後、標準的なMTTアッセイを実行して、相対的な細胞生存率を決定しました。 ROSの細胞内生成は、蛍光測定細胞内Rosアッセイキット（sigma、USA）を使用した分光光度法を使用して化学的に検出されました。細胞を共焦点ディッシュ（直径=15 mm）で一晩培養し、細胞を接着させました。次に、細胞を200μgmL ^-1 とインキュベートしました。 4時間のCQD。続いて、100μL/ウェルのマスターリアクションミックスを添加しました。 1時間のインキュベーション後、細胞を4％パラホルムアルデヒドで10分間固定し、細胞の蛍光画像をCLSMで観察しました。 ROS産生の検出に関しては、細胞を200μLの培地を含む96ウェルプレートで培養しました。 24時間のインキュベーション後、培地を0、100、200μgmL ^-1 の濃度の100μLのCQD溶液に交換しました。 、細胞をさらに4時間インキュベートしました。続いて、サンプルをPBSで3回洗浄し、15分間照射するかどうかにかかわらず、100μL/ウェルのマスターリアクションミックスで1時間インキュベートしました。最後に、蛍光リーダーを使用して蛍光強度を検出しました（520 nm励起、605 nm発光）。

統計分析

この研究に含まれる実験は3回繰り返され、統計分析はSPSS19.0を使用して実行されました。 2つのグループの違いは、マンホイットニー U を使用して比較されました。 テスト。 Hela細胞上の励起されたCQDのIC50は、非線形回帰を使用して評価されました。 P <0.05は統計的に有意であると見なされました。

データと資料の可用性

現在の研究のすべてのデータと資料は、合理的な要求に応じて対応する著者から入手できます。

略語

PDT：

光線力学療法

ROS：

活性酸素種

CQD：

カーボン量子ドット

TEM：

透過型電子顕微鏡

CLSM：

共焦点レーザー走査型顕微鏡

DMEM：

ダルベッコの改良イーグル培地

MTT：

3-（4,5-ジメチルチアゾリル-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド

DMSO：

ジメチルスルホキシド

IC50：

最大阻害濃度の半分