アルブミンナノスフィア内の標的MoSe₂ナノドット：相乗的光熱放射線療法のための生体適合性二重機能エージェント

要旨

光熱機能と放射線治療機能を単一の腫瘍特異的ナノプラットフォームに統合することは、がん治療の新たな戦略として台頭している。超微細モリブデンセレニド（MoSe₂）ナノドット（ND）を牛血清アルブミン（BSA）ナノスフィア（NS）上に組み立て、ポリエチレングリコール（PEG）リンカーを介して葉酸（FA）を共役させることで、二重機能エージェントを設計した。得られたFA-MoSe₂@BSA NSは、強力な近赤外（NIR）吸収とX線減衰を示し、効率的な光熱加熱と放射線感受性化を可能にする。in vitroおよびin vivo試験で、標的腫瘍取り込み、優れた生体適合性、NIRおよびX線照射併用時の腫瘍生存率の相乗的低減を実証。これらの知見は、FA-MoSe₂@BSA NSが臨床光熱放射線療法（PTT-RT）向けの有望な多機能プラットフォームであることを示している。

背景

乳がんは世界中で主要な罹患原因であり、高い転移率と再発率を示す。従来療法（手術、化学療法、放射線療法（RT））は健常組織を損なうことが多く、特に低酸素腫瘍微小環境では効果が限定的。最近の光熱療法（PTT）の進展は、低侵襲と高空間特異性を示すが、PTT単独では深部やアクセス困難な腫瘍の根治に失敗しがち。注目すべきは、NIR誘起高熱が腫瘍酸素化を高め、がん細胞をRTに感受性させることである。したがって、PTT-RT併用は治療効果を最大化し、付随損傷を軽減する魅力的な道筋を提供する。

二次元遷移金属ダイカルコゲナイド（TMD）、MoS₂、WS₂、ReS₂などは、独自の電子特性により強力なNIR吸収体と放射線感受性剤として台頭している。モリブデンセレニド（MoSe₂）は特に強い光熱変換と高いX線減衰を示し、二重モード療法の魅力的候補となる。しかし、MoSe₂ NDの生理条件下での固有の不安定性が臨床応用を制限している。BSAなどのタンパク質マトリックス内へのカプセル化は、これらのナノドットを安定化し生体適合性を付与し、FA共役は多くのがん細胞で過剰発現する葉酸受容体を介した腫瘍標的化能を付与する。

方法

材料

FA-PEG₅₀₀₀-NHSとCH₃-PEG₅₀₀₀-NHS（上海Ponsure Biotech）、バルクMoSe₂（Sigma-Aldrich）、BSA（≥98%純度）、標準細胞培養試薬（Corning）を使用。

FA-MoSe₂@BSA NSの調製

バルクMoSe₂（50 mg）を蒸留水25 mLに分散し、超音波処理（950 W、25 kHz、2秒on/3秒off）で12時間処理し超微細NDを得た。遠心分離（6000 rpm、25分；次に12,000 rpm、30分）で上澄みを回収し、MoSe₂ NDを含有。BSA 25 mgを添加し、25℃、pH 7.4で6時間攪拌しコアセルベート形成。0.5%グルタルアルデヒド（250 µL）で架橋。透析（1日）で過剰架橋剤を除去し、MoSe₂@BSA NSを得た。FA共役化のため、FA-PEG₅₀₀₀-NHS 8 mgをNSと混合し2時間攪拌；平行してCH₃-PEG₅₀₀₀-NHS（8 mg）で非標的対照を調製。透析で精製完了。UV-Vis分光法（280 nm）でFA担持量を定量し、封入効率10.5±0.11%を得た。

キャラクタリゼーション

透過型電子顕微鏡（TEM）と走査型電子顕微鏡（SEM）で、超微小NDコア（≈3.8 nm）と球状NS形態（≈140 nm）を確認。動的光散乱（DLS）で水、PBS、培養液中での安定な流動径を確認。UV-VisスペクトルでMoSe₂ NDとFA-MoSe₂@BSA NSの強いNIR吸収を確認。X線回折（XRD）で特徴的(002)ピークを観察し、少層MoSe₂構造を示唆。フーリエ変換赤外（FTIR）スペクトルでFAとBSA間のアミド結合形成を確認。光熱安定性を3サイクルレーザー照射（808 nm、1 W cm⁻²）で評価し、温度上昇に損失なし。コンピュータ断層撮影（CT）イメージングで濃度依存的ハウンスフィールド単位（HU）値を確認し、X線減衰能を実証。

細胞取り込みと生体適合性

FITC標識と共焦点顕微鏡で、FA共役NSの4T1細胞への取り込みが非標的NSより増強されることを確認；過剰遊離FAでブロッキングすると取り込み減少し、葉酸媒介エンドサイトーシスを確認。誘導結合プラズマ原子発光分光法（ICP-AES）でMo含有量を定量し、共焦点所見を裏付け。溶血アッセイ（0-400 µg mL⁻¹）で<5%溶血、CCK-8生存率アッセイ（0.01-0.4 mg mL⁻¹）で24時間後>90%細胞生存を示し、低細胞毒性を実証。

in vitro光熱放射線療法

808 nm照射（1 W cm⁻²、5分）下で、FA-MoSe₂@BSA NS（200 µg mL⁻¹）が局所温度を約41℃上昇（PBSは約1.5℃のみ）。X線照射（0-5 Gy）と併用で、FA共役NSが4T1生存率を有意に低下させ、1 W cm⁻² NIRと5 Gyで92.8%細胞死を達成。非標的NSや単一モダリティを上回った。

in vivo生体分布と光熱効果

4T1移植BALB/cヌードマウスでの蛍光とICP-AESマッピングで、FA-MoSe₂@BSA NSの腫瘍蓄積が投与24時間後（10 mg kg⁻¹）にピーク。血中半減期は分布相0.91時間、消失相16.96時間。24時間後にNIR照射（808 nm、1 W cm⁻²、5分）で腫瘍温度約22℃上昇を確認し、in vivo光熱性能を実証。

in vivo光熱放射線療法

6群試験（PBS、NIR、RT、MoSe₂@BSA+NIR+RT、FA-MoSe₂@BSA+NIR、FA-MoSe₂@BSA+NIR+RT）で、FA共役二重モード群が30日間で最も顕著な腫瘍抑制（≥80%体積減少）を達成。体重減少や臓器毒性なし（H&E染色と全血球計数が正常範囲）。

結論

FA共役MoSe₂ナノドットをBSAナノスフィアにカプセル化し、安定、腫瘍標的、生体適合性を備えた二重機能エージェントを作製することに成功。強いNIR吸収とX線減衰により、相乗的な光熱効果と放射線感受性化を実現し、最小限の全身毒性で優れたin vitroおよびin vivo腫瘍消融を示す。これらの多機能ナノスフィアは、結合光熱放射線療法の将来的な臨床翻訳への魅力的なプラットフォームを代表する。

略語

BSA

牛血清アルブミン

FA

葉酸

MoSe₂

モリブデンセレニド

NDs

ナノドット

NIR

近赤外

NSs

ナノスフィア

PEG

ポリエチレングリコール

PTT

光熱療法

RT

放射線療法