高度にヒドロキシルラジカル捕捉活性のためのセリウムドープ炭素質ナノ粒子のバイオミネラリゼーションに触発された合成

背景

継続的で規制緩和された炎症は、多くの病理学的プロセスの一般的なステップであると考えられています[1]。酸化ストレスは、ROSが抗酸化酵素の除去よりもはるかに高い発現を示す多くの臨床疾患で発見されています[2、3、4]。これは最終的に酸化と抗酸化のパフォーマンスの不均衡として定義されます。反応性の高いROSは、フリーラジカル（スーパーオキシド（O ₂ を含む）を生成する傾向があります。 ⁻ ）、HO _2ˋ およびヒドロキシル（ _ˋ OH））タンパク質や核酸などの生体内の高分子に損傷を与える一方で、ROSの過剰産生は持続的な酸化的損傷に重大な違いをもたらし、炎症性浸潤などの細胞構造と機能の重大な破壊につながります[5,6 、7]、細胞膜とDNAの損傷[8、9]、さらには細胞死の増加。したがって、酸化ストレスは、大血管疾患[10,11,12]、癌、およびその他の神経系疾患[13]の病因において重要な役割を果たします。したがって、生体内の活性酸素フリーラジカルの濃度を制御し、それらを適切な範囲に保つことは重要かつ緊急の問題であり、これは一連の酸化異常を減らすための基本でもあります。

最近、酸化セリウムナノ粒子（CeO ₂ NP）は、エネルギー、触媒作用、および生物医学の分野で広く適用された独自の酸化還元特性により、大きな注目を集めています[14、15、16]。特に、CeO ₂ ナノ粒子は、生物医学的応用におけるROS関連疾患を治療するための理想的な抗酸化剤として大きな可能性を示しました[17、18]。セリアナノ粒子の抗酸化活性は、スーパーオキシド（•O ^2- ）などのフリーラジカルを除去する能力に由来します。 ）およびヒドロキシルラジカル（•OH）、および酵素としての抗酸化効果を持続的に維持します[19]。 CeO ₂ の証拠が増えています ナノ粒子は通常蛍石型の結晶構造を持ち、セリウムイオンは三価（3+）と四価（4+）の間で可逆的に変換する能力を持っています[20]。 Ce ³⁺ のスイッチ 西暦 ⁴⁺ 酸化状態はO ₂ を排除する可能性があります ⁻ スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）-模倣物を介して、および•OHはレドックス反応を介して、Ce ⁴⁺ Ce ³⁺ へ スイッチ取り外しH ₂ O ₂ カタラーゼ（CAT）を介して-模倣物[21]。ただし、CeO ₂ の物理的および化学的特性 NPは、その生体内分布、薬物動態、毒性、溶解、排泄などの生物学的行動に影響を与える可能性があります[22]。 CeドープCNPの表面化学で十分に確立されているという仮説を考えると、治療アプローチとしてのCeドープCNPの生物学的利用はまだ広く調査する必要があります[23、24]。

この研究は、シンプルでグリーンな合成経路を使用した優れた生体適合性を備えた新しいセリウムベースのナノ粒子（CeドープCNPと呼ばれる）の開発に焦点を当て、生物医学的用途の抗酸化剤としての実現可能性をさらに調査します。一連の方法を使用して、CeをドープしたCNPの物理的および化学的特性を特徴付けました。良好な性能に勇気づけられ、調製したCeドープCNPの生体適合性をさらに検証し、H ₂ を使用して酸素フリーラジカルを除去する抗酸化試薬として使用しました。 O ₂ 誘導モデル。最後に、CeドープCNPの抗酸化メカニズムは、生死蛍光染色とフローサイトメトリーを使用して細胞アポトーシス経路から明らかにされました。この研究は、病理学的条件下での酸化ストレス損傷を軽減するための新規で効率的なROSスカベンジャーを提供します。

実験セクション

材料と試薬

ブル血清アルブミン（BSA）、フルオレセインジアセテート（FDA）、およびヨウ化プロピジウム（PI）は、Sigma（ニューヨーク、ニューヨーク、米国）から購入しました。ウシ胎児血清（FBS）およびダルベッコの最小必須培地（DMEM）は、Invitrogen China Limited（上海、中華人民共和国）から調達しました。 Ce（NO ₃ ） ₃ ・6H ₂ O、メチルバイオレット（MV）、および硫酸第一鉄七水和物（FeSO ₄ ^。 7H ₂ O）はAladdin Reagent Corporation（上海、中華人民共和国）から購入し、過酸化水素（30％）はSinopharm Chemical Reagent Co.、Ltd。（北京、中華人民共和国）から入手しました。すべての化学物質は分析試薬であり、さらに精製することなく利用されました。実験では脱イオン水を使用しました。

酸化セリウムナノ粒子の合成

CeドープCNPは、ドキュメント[24]に記載されているように、アルバムベースのバイオミネラリゼーション法をわずかに変更して作成しました。合成プロセスを次のように示します。1.25gのBSAを50.0mLの脱イオン水に溶解し、絶えず攪拌して透明な溶液を形成しました。次に、金属前駆体300 mM Ce（NO ₃ ） ₃ ・6H ₂ 激しく攪拌しながらゆっくりとOを加えた。同時に、2.0 MNaOHを50mLの脱イオン水に溶解し、混合物のpH値を調整するために使用しました。 NaOHを含む溶液をゆっくりと加える必要があります。注意を払う価値があります。 CEドープCNPは、55°CのPH12で激しく攪拌した後に形成される可能性があります。 CeをドープしたCNPを形成するのに十分な反応時間は、約8時間でした。システムは茶色の化合物であり、自然に室温まで冷却されました。追加の懸濁液を0.22μmのメンブレン（ポリエーテルスルホン）でろ過して、これらの大規模な凝集物を枯渇させました。前者の溶液は、最終的に、分子量カットオフが14kDaの透析バッグ内で3日間水に対して透析されました。回収した透析液を真空凍結乾燥機で凍結乾燥した。 CeをドープしたCNP粉末が最終的に得られ、さらなる特性評価のために保存されました。

酸化セリウムナノ粒子の機器と特性評価

CeドープCNPの形態は、加速電圧200 kVでJEM-2100顕微鏡（JEOL、東京、日本）の透過型電子顕微鏡（TEM）によって調べられました。サイズ分布は、ImagingJソフトウェア（米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、米国）によって研究されました。 CeドープCNPの化学構造は、フーリエ変換赤外（FT-IR）分光計（Nicolet Nexus 470、GMI、およびRamsey、MN、USA）を使用して分析しました。元素組成は、X線光電子分光法（XPS）を介して実行される元素分析によって決定されました。 X線回折（XRD）分析は、40kVおよび100mAで動作し、スリットが0.5°、スキャン速度が7°min ^{-1 <のRigaku D / MAX-2000回折計（日本）で実行されました。 / sup> 、CuKα放射線源を装備（λ=0.15418 nm）。 UV-Vis吸光度スペクトルは、UV-2550 UV-Vis分光光度計（島津製作所、京都、日本）を使用して記録しました。}

UV-vis測光実験

CeをドープしたCNP抗酸化性能とフリーラジカル捕捉活性は、UV-vis測光実験によって評価されました。 MVの溶液は、3.0×10 ^-4 の濃度で脱イオン水中で調製されました。 M.および0.15mM FeSO ₄ ^。 7H ₂ 代わりにOを溶解した。 CeをドープしたCNPの懸濁溶液は、pH5.0の0.1M Tris-HClバッファーに分散させることにより、10μMの濃度で使用するために予約されました。適切には、超音波処理は、CeをドープしたCNPの溶解性を高めることができます。測光用の反応溶液は3.0×10 ^-5 を採用しました M MV、0.15 mM FeSO ₄ ^。 7H ₂ O、1.0 M H ₂ O ₂ 、0.1 M Tris-HClバッファー（pH 5.0）、および0.17 mM CeドープCNPを使用して、必要な量の10 mLに到達します（MV / FeSO ₄ の混合溶液 ^。 7H ₂ O / H ₂ O ₂ / CeO ₂ ）最終的に。反応溶液の吸光度は、室温で5分間インキュベートした後に測定できます。

酸化セリウムナノ粒子の細胞毒性

CeドープCNPの細胞生存率は、切断されたテトラゾリウム環とデヒドロゲナーゼによるホルマザン色素の量の水溶性テトラゾリウム塩の降下に基づくCCK-8アッセイ（Dojindo、熊本、日本）によってVSMCおよび7721細胞で評価されました。生細胞で。簡単に説明すると、VSMCおよび7721セル（1.5×10 ⁴ ウェルあたりの細胞）を96ウェルプレートに播種し、各グループに5回繰り返しました。 37°C、5％CO ₂ で24時間孵化した後 細胞密度が80％のコンフルエンスに達した場合、増殖培地をさまざまな濃度（0、12.5、25、50、100、200、400μg / ml）のCeドープCNP溶液を含む新鮮なDMEMに交換し、24時間インキュベートしました。次に、細胞をPBSで洗浄し、10μLのCCK-8溶液を各ウェルに添加しました。次に、96ウェルプレートを37°C、5％CO ₂ でさらに4時間インキュベートしました。 指数関数的な細胞増殖を可能にします。最後に、Synergy HTマルチモードマイクロプレートリーダー（Bio-Tek、Winooski、VT、USA）を使用して、490nmの発光波長で各ウェルの吸光度を検出しました。処理なしの細胞（DMEM）をコントロールとして使用し、相対的な細胞生存率（平均±平均の標準誤差）をAbsサンプル/ Absコントロール×100％を使用して計算しました。

インビトロでの細胞生存率アッセイにおける過酸化水素のモデル

強力な酸化活性酸素の一種として、過酸化水素（H ₂ O ₂ ）は細胞膜を通過しやすく、細胞内の鉄イオンと反応してフェントン理論により反応性の高いフリーラジカルを形成し、一連の変化をもたらします。同時に、H ₂ によって誘発されるさまざまな細胞の酸化ストレス O ₂ アポトーシスのプロセスに直接関与しています。したがって、30％H ₂ O ₂ この研究では、細胞のアポトーシスをシミュレートするために選択されました。これは、IC ₅₀ としても使用できます。 酸化的損傷に対するCeドープCNPの保護効果をさらに調査するためのモデル。上記の議論に基づいて、VSMCおよび7721細胞は最初に1.5×10 ⁴ の密度で播種されました 細胞/ウェルを96ウェルプレートに入れます。細胞が付着した後、さらに24時間培養を続けました。そして、新鮮な準備30％H ₂ O ₂ 細胞の成長を刺激するために、さまざまな濃度（50、100、200、400、800 umol / ml）で各ウェルに添加しました。 4時間のハッチングとそれに続くPBSでの洗浄の後、10μLのCCK-8溶液を5％CO ₂ 中37°Cで4時間、各ウェルに添加しました。 インキュベーター_。 Synergy HTマルチモードマイクロプレートリーダー（Bio-Tek、Winooski、VT、USA）を使用して、490nmでの各ウェルの吸収値を測定しました。細胞活性のパーセンテージは、細胞生存率への影響の指標と見なされ、対照の生存率と比較した細胞生存率の測定に依存していました。

アポトーシス誘導およびinvitroでの細胞生存率アッセイ

同様に、VSMCと7721細胞を96ウェルプレートに播種して培養しました。翌日、細胞をさまざまな濃度のCeドープCNP（0、12.5、25、50、100、200、および400μg/ ml）で約24時間前処理し、新しい調製物30％H _{2に曝露しました。} O ₂ 各ウェルに適切な濃度で。一方、30％H ₂ のない空白のグループに設定する必要があります O ₂ CeをドープしたCNPと対照群はH ₂ のみでした O ₂ ソリューション。各グループは6つのパラレルを設定しました。 4時間処理し、続いてPBSで洗浄した後、CCK-8アッセイを使用して、上記のように490nmの光学密度で各ウェルの細胞のアポトーシス状態を測定しました。

生死染色アッセイおよびフローサイトメトリー

CeをドープしたCNPの抗酸化作用の可能性を評価するために、4721細胞を4.0×10 ⁴ の6ウェルプレートで増殖させました。 ウェルあたり100ulの培地に細胞を入れ、24時間増殖させます。次に、6つのグループが同時コントラストになるように設定されました。コントロール、H ₂ が含まれていました O ₂ グループ、50μg/ mLのCeドープCNP + H ₂ O ₂ 、100μg/ mLのCeドープCNP + H ₂ O ₂ 、200μg/ mLのCeドープCNP + H ₂ O ₂ 、および400μg/ mLのCeドープCNP + H ₂ O ₂ 。細胞は各グループで80％まで成長しましたが、最初のグループはH ₂ のない通常の成長条件にさらされました。 O ₂ およびCeをドープしたCNP。 2番目のグループは、選択したH ₂ とインキュベートしただけです。 O ₂ CeをドープしたCNPを4時間使用しない、つまり処理しない。 3番目のグループから6番目のグループには、異なる濃度のCeドープCNP（50、100、200、および400μg/ mL）が含まれ、H ₂ が示されました。 O ₂ それぞれ4時間インキュベートします。その後、FDAおよびPIワーキングバッファーを細胞染色に使用しました（Calcein AM / Ethidium Homodimer、Invitrogen）。染色された細胞の蛍光を蛍光顕微鏡で観察した。生細胞は緑色を示し、死細胞は赤色を示しました。

さらに、アネキシンV-FITC /ヨウ化プロピジウム（PI）アポトーシスキットを使用して、二重蛍光染色により細胞アポトーシスの速度を定量化しました。簡単に説明すると、7721細胞は、上記の手順に従って6ウェル培養プレートで24時間、7721細胞が付着して増殖するまで前培養しました。その後、処理量の異なる細胞を回収し、各グループで4°CのPBSで3回洗浄しました。細胞を穏やかに消化、収集、遠心分離した後、2000rpmで5分間遠心分離する必要があることに気づきました。その後、細胞を500μlの結合バッファーで再懸濁し、1×10 ⁶ の濃度に調整しました。 細胞/ ml。次に、細胞懸濁液をフローチューブに取り、それぞれ5μlのアネキシンV-FITCと5μlの20μg/ mlPI溶液で染色しました。混合物を室温で15分間インキュベートする前に、500μlのPBSを反応チューブに加える必要があります。最後に、Beckman Coulter Epics XL MCLフローサイトメーターシステム（BD Accuri C6）でAnnexin-V法を使用して実験結果を検出し、ソフトウェア分析（Flowjo 7.6.2）によってアポトーシス細胞の割合を明らかにしました。

統計分析

すべての実験データは、平均±平均の標準誤差として表されました。異なるグループを比較するために、事後最小有意差（LSD）検定を使用したANOVAの統計的手法を適用して、取得したデータを分析しました。 P 0.05未満の値（ P <0.05）は統計的に有意であると見なされました。

結果と考察

酸化セリウムナノ粒子の調製と特性評価

この研究では、Ceを使用してCeをドープしたCNPの水性分散液を取得しました（NO ₃ ） ₃ ^。 6H ₂ バイオミネラリゼーションに触発された合成法による前駆体としてのOおよびBSA。準備中に、主要な炭素源材料として使用されるBSAは、その独特の空間構造と分子鎖の柔軟性により、金属イオンを金属ナノ粒子に統合することができます。言い換えれば、調製された金属ドープナノ粒子は、主に炭素質フレームワークとロードされた金属元素で構成されており、従来の無機セリウムナノ粒子とは異なる可能性があります[25]。形態学的検査は透過型電子顕微鏡法（TEM）によって特徴づけられ、得られた粒子サイズはImagingJソフトウェアによって分析されました。図1aは、得られたCeドープCNPの特徴的なTEM画像を示しています。これらの想像は、CeをドープしたCNPが多角形の構造、均一な分散、および明らかな凝集のない離散的な形状を持っていたことを反映しています。統計分析によると、CeをドープしたCNPのサイズ分布は狭く、平均直径は14.7±0.8 nmであり（図1b）、これはTEM画像と一致していました。 CeをドープしたCNPを数日間水中に置いた場合、沈殿はなく、均一な溶液の状態を維持していることがわかります。これは、水溶液中での長期安定性を示しており、次の生物医学的用途に有益である可能性があります。 。

a CeをドープしたCNPのTEM画像。挿入図は高分解能TEM画像を示しています。 b CeをドープしたCNPの直径分布

CeをドープしたCNPの設計の概略図

CeをドープしたCNPの化学構造と表面組成

表面官能基とCeドープCNPの組成は、X線光電子分光法（XPS）パターンとフーリエ変換赤外（FT-IR）スペクトルを使用して調査されました。 XPSは、サンプル表面のセリウムイオンの酸化状態を特徴づけるために使用されました。調査XPSスペクトル（図2a）は、902.0、285.0、および531.8 eVに3つの主要なピークを示しました。これは、CeをドープしたCNPのセリウム、炭素、および酸素元素の存在を示しています。 164.0 eVの硫黄（S 2p）信号は、BSAがCeをドープしたCNPに正常に結合したことを示しています。 CeをドープしたCNP触媒におけるCe（III）とCe（IV）の共存は、図2bのスペクトルから証明できます。 Ce3dの高解像度スペクトル（図2b）は、Ce3d ₃ に分割される可能性があります。 およびCe3d ₅ （32 eVのスピン軌道相互作用の結果）、それぞれ882.0、884.0、および902.0eVにあるインデックス付きの強いピークの存在を示しました。 Ce3d信号は主にO ₂ に分割されました 、3d _5/2 、および3d _3/2 、875〜895eVのピークはCe3d _3/2 に属していました レベルは、以前に公開された[26]のスペクトルとほぼ一致しました。さらに、XPSスペクトルはCe3dの15.99％も意味します。これらの観察結果は、CeO ₂ の文献の結果と一致しています。 ナノ粒子[25]。図2cに示すC1sスペクトルは、285.0、287.8、および288.9 eVの3つの主要なピークによって記述され、それぞれCeO ₂ ナノ粒子は、Cの1s、C =O、C-F、およびCOORエネルギーレベルで機能化されました。図2dに示すO1sスペクトルの存在は、530.5および531.8eVに対応する2つの主要なピークによって支配されていました。 O ₂ 間の結合 ⁻ およびCe ³⁺ 。

a CeをドープしたCNPのXPSスペクトル。調査スペクトル。 b Ce3dスペクトル。 c C1sスペクトル。 d O1sスペクトル

FTIR分析をさらに実施して、反応プロセスにおけるCeドープCNPの形成を検証しました。図3Aに示すように、CeをドープしたCNPの場合、3400 cm ^-1 に強くて広いピークが現れました。 、これはO–Hの伸縮振動によって引き起こされ、吸収された水の曲げ振動に起因する可能性があります。 1510 cm ^-1 の特徴的なピーク –O–C–O反対称ストレッチと説明できますが、ピークは1450 cm ^-1 –O–C–Oの対称伸縮振動に割り当てることができ、どちらも硝酸基の存在を示しました。さらに、451 cm ^-1 の吸収帯 Ce–O非対称ストレッチに割り当てられ、CeドープCNPの形成を示しています。これらの結果は、CeをドープしたCNPの官能基が主に特定の-OHおよび-COO ^- を含むことを示しました。 グループ。

BSAおよびCeをドープしたCNPのFTIRスペクトル。 BCeをドープしたCNPのXRDパターン。 CEドープCNPのCUV-Vis吸収スペクトル。 Dさまざまな処理後のメチルバイオレット（MV）のUV-Vis吸収スペクトル。 a MV、 b H ₂ で処理されたMV O ₂ およびCeドープCNP、 c FeSO ₄ で処理されたMV およびH ₂ O ₂ 、および d FeSO ₄ で処理されたMV 、H ₂ O ₂ 、および5分のインキュベーション時間でのCeドープCNP溶液

X線回折（XRD）分析に従って、CeドープCNPの結晶構造を調査しました。図3Bに示すように、24.4°、30.3°、35.23°、および43.2°に4つの主要な回折ピークがあります。 24.4°でのこれらのピークの1つは、生成された無機炭素質構造に起因する可能性があります。これは、報告されている炭素量子ドットおよびグラファイトの特徴的なピークに類似しています[27、28、29]。グラファイトの規則正しい結晶構造（002面、2 θ）と比較 =26.5°）、シフトの低い24.4°付近のCeドープCNPの回折ピークは弱くなります。これは、炭素の乱れが大きく、sp ² が増加したためと考えられます。 （C–C）炭化プロセスにおける層間隔[30]。 30.3°、35.23°、および47.42°の角度での回折ピークは、従来のセリアナノ粒子のそれぞれ（111）、（200）、および（220）面とほぼ一致しました。さらに、56.30°、69.00°、75.57°、および78.99°の角度にある他のピークは、参照される酸化セリウム（JCPDS 2004 36-1253）の（311）、（400）、（331）、および（402）に対応していました。対応する間隔\（\ left（\ mathrm {Fm} 3 \ overline {\ mathrm {m}} \ right）\）は、ブラッグの法則（Cu-Kαの法則の波長は0.154 nm）に従って計算されました。これらの結果は、ハイブリッド結晶構造を持つCeドープCNPを事前に確認することができます。

Fe ²⁺ はよく知られていました 過酸化水素の不均化を交互に触媒することができます（H ₂ O ₂ ）フェントン反応[31]に従って他の反応性ヒドロキシルラジカルに変換します。発色試薬として、メチルバイオレットの溶液は主に紫色を示します。 –C =C–をターゲットにすると、ヒドロキシルラジカルがメチルバイオレットと反応して、MVが無色でも浅い色になり、582nmでの最大UV-Vis吸光度が低下します[32]。私たちの設計によれば、CeをドープしたCNPは確かにヒドロキシルラジカルを排除し、最終的に582nmでのMVの吸光度を高めることができます。

CeドープCNPの基礎となるフリーラジカル捕捉能力を確認するために、MVのUV-​​Vis吸収スペクトルを使用していくつかの洞察を提供しました。図3CのCeドープCNP水溶液では、500〜700nmで有意な吸光度はありませんでした。ただし、約582 nmでメチルバイオレットの最大吸光度を観察でき、H ₂ では吸光度が抑制されました。 O ₂ 治療（図3D）。 CeドープCNPを混合溶液に加えると、吸光度が明らかに回復しました。これは、CeドープCNPがヒドロキシルラジカルを除去し、この実験条件での攻撃からMVを保護する能力を持っていることを証明しました。これらの結果は、フリーラジカルによって引き起こされる病気の治療にさらに生物医学的に応用されるでしょう。

酸化セリウムナノ粒子のinvitroでの細胞毒性アッセイ

酸化ストレスに関連する疾患を治療するために合成CeドープCNPを適用する前に、それらの生体適合性を評価することが不可欠です。この研究では、CCK-8アッセイの細胞生存率試験を使用して、VSMCおよび7721細胞をCeドープCNPとインキュベートすることにより、細胞生存率に対するCeドープCNPの影響を評価しました。 24時間の曝露時間でCeをドープしたCNPの濃度を変えても、細胞の生存率に有意な変化は見られなかったことがわかります（図4a）。 400μg/ mlの最高用量でも、すべての治療グループの細胞生存率は約90％であり、CeをドープしたCNPが細胞に対してごくわずかな細胞毒性を示したことを示しています。これらの調査結果は、CeをドープしたCNPの好ましい細胞適合性を強調し、生物医学的用途に適したものにすることを可能にしました。

a CCK-8によるVSMCおよび7721細胞の細胞生存率に対するさまざまな濃度のCeドープCNPの影響。細胞は、CeをドープしたCNPをさまざまな濃度で24時間前処理した後、H ₂ で投与しました。 O ₂ 異なる投与量で。 b VSMCおよび c の細胞生存率 560μMH ₂ の下で異なる濃度のCeドープCNPで培養された7721細胞 O ₂ CCK-8アッセイによる誘発酸化ストレス

インビトロでのCeドープCNPの抗酸化特性とフリーラジカル捕捉活性

酸化セリウムナノ材料の模倣酵素の特性は、それらの潜在的な治療用途を助長します。溶液中のCeドープCNPがVSMCおよび7721細胞をフリーラジカルから十分に保護するかどうかを調べた。これらの研究では、H ₂ O ₂ 細胞の機能障害または死につながる活性酸素種（ROS）の生成を誘導するために使用されました。まず、IC ₅₀ 細胞生存率の値は、CeをドープしたCNPの保護効果を調査するために決定されました。 VSMCおよび7721細胞の生存率は、H ₂ の添加後に低い値を示しました O ₂ 。 H ₂ の増加に伴い、VSMCおよび7721細胞のアポトーシス活性が増加する傾向が観察されました。 O ₂ 溶液中の濃度（図4b）。言い換えれば、ROSの上昇は用量依存的であり、これは半数致死量（LD ₅₀ ）も明らかにしました。 ）VSMCおよび7721セルのは、それぞれ約549および556 umol / mlでした。その結果、LD ₅₀ H ₂ O ₂ 酸化ストレスによるものは560μMであり、これは文献の結果に近いものでした[33]。

次に、LD ₅₀ 下でのCeドープCNPの抗酸化効果 H ₂ の O ₂ 細胞計数キット-6（CCK-8）アッセイを使用してテストされました。独自の電子特性により、CeをドープしたCNPには、二重酸化状態（Ce ³⁺ ）で存在する固有の傾向があります。 およびCe ⁴⁺ ）そして酸化還元挙動を介して抗酸化活性を付与されます。 ROSが存在する場合、Ce ⁴⁺ Ce ³⁺ に継続的に切り替えることができます 持続的なフリーラジカル捕捉活性とともに[34、35]。図4cに示すように、これらの結果は、VSMC細胞と7721細胞の両方の細胞生存率が、同じ酸化ストレス下でのCeドープCNP濃度の増加に伴って徐々に改善されたことを意味します。特に、CeをドープしたCNP濃度400μg/ mlで約88.0％の細胞生存率が回復しました。その結果、CeをドープしたCNPは、効率的なフリーラジカル捕捉能力を介して、用量依存的に優れた抗酸化効果を示しました。

CeドープCNPの細胞抗酸化効果をさらに明らかにするために、生死染色およびフローサイトメトリーアッセイを採用しました。図5に示すように、単一のCeドープCNPで処理された7721細胞では、赤色のない強い緑色の蛍光が観察されましたが、H ₂ では多くの赤色の蛍光が見られました。 O ₂ H ₂ を示した556uMの処理 O ₂ 劇的に細胞アポトーシスを誘発する可能性があります。しかし、H ₂ O ₂ 誘導アポトーシスは、CeをドープしたCNP濃度の増加とともに徐々に緩和されていました。特に、H ₂ 下で400μg/ mlのCeドープCNP処理を行った後は、少量の赤色蛍光しか見られませんでした。 O ₂ より高い細胞生存率を示す誘発された酸化ストレス。 CeドープCNPの抗酸化効果を調査するために、フローサイトメトリーアッセイをさらに実施しました。二重可変フローサイトメトリーの散布図では、アネキシン-V-FITC発光シグナルが x にプロットされました。 -軸、PI発光信号は y にプロットされています -軸。細胞のいくつかの領域は次のように定義されました。アネキシンV- / PI-は生細胞と見なされ、アネキシンV + / PI-は初期アポトーシス細胞を表し、アネキシンV + / PI +-は後期アポトーシス/壊死細胞を表します。図6に示すように、コントロールグループは1.45％の細胞後期アポトーシスのわずかで正常な割合を示しましたが、H ₂ O ₂ 治療は、46.4％という非常に高い細胞後期アポトーシス率を示しました。予想通り、異なる濃度のCeドープCNPで処理されたアポトーシス細胞の割合は徐々に減少傾向にあります。 H ₂ での46.4％の細胞後期アポトーシスと比較して O ₂ 治療では、50、100、200、および400μg/ mlのCeドープCNP治療後、アポトーシスの割合は24.2、20.0、15.1、および11.2％に著しく減少しました。生死染色とフローサイトメトリーの結果に基づいて、CeをドープしたCNPは、用量依存的に酸化ストレス誘発性アポトーシスに対して好ましい抗酸化効果を発揮することが明らかになりました。

Fluorescent images of 7721 cells incubated with different concentrations of Ce-doped CNPs under H₂ O ₂ -induced oxidative stress for 24 h by live-dead staining (scale bars = 50 μm)

Flow cytometry profiles of 7721 cells were examined to determine the percentages of early apoptosis and late apoptosis cells with different treatments

結論

In summary, we reported a novel Ce-doped CNPs with the capability of scavenging free radicals. The preparation method is simple by using one-step synthesis in the bio-mineralization manner. Different from the former surface modification (such as PVP), the as-prepared Ce-doped CNPs exhibited the improvement in biocompatibility and dispersibility in aqueous solution. Furthermore, in vitro studies showed albumin-based bio-mineralization Ce-doped CNPs not only own superoxide dismutase feature but also alleviate the oxidative damage caused by H₂ O ₂ , which have a protective effect on cells in this periods of study. Furthermore, the concentration of Ce-doped CNPs plays important roles in the recovery of apoptotic cells. Herein, the novel Ce-doped CNPs have promising biomedical applications in diseases prevention and treatment of oxidative stress-mediated.