近赤外光音響イメージング用の調整可能なアスペクト比の金ナノロッドのシード媒介合成

背景

ナノワイヤー、ナノロッド、ナノチューブ、ナノベルトなどの1次元（1D）ナノ構造は、ナノデバイスの新しい基本的な構成要素であるだけでなく、特殊なアプリケーション向けの異方性機能を生成する高い幾何学的アスペクト比を備えているため、特に興味深いものです[1 2,3,4,5,6]。これらの1Dナノ構造の中で、新しい金属ナノロッド（NR）は、形状に依存する表面プラズモン共鳴（SPR）バンド[7、8]、容易な合成[9,10,11]、好ましい生体適合性、および容易さのためにますます関心を集めています。変更[12、13、14]。たとえば、Yeh etal。は、100 nm未満のAuナノロッド（AuNR）シェル構造を報告しました。これは、600〜900 nmで強い縦方向の吸光度を示し、光誘起治療への優れた適用性を示します[8]。王ら。 DNA捕捉鎖の配置の設計された「X」パターンの折り紙にDNAを含む官能化AuNRを配置することにより、調整されたキラリティーを備えた異方性AuNRヘリカル超構造の構築に成功しました[12]。

さらに、AuNRの合成と精製の改善により、光音響イメージング（PAI）や光誘起などの特定のアプリケーション向けに、長さ、したがってアスペクト比[15,16,17]を調整することにより、縦方向のSPRバンドを簡単に調整できるようになりました。生物学的組織の光透過ウィンドウに入るには、Au NRの縦方向のSPRが必要な治療法[18、19、20、21、22、23]（最初は700〜950 nm、2番目は1000〜1350 nm）[8 、18]。たとえば、Huangらは、アスペクト比が2.4から5.6の金NRを合成し、効率的な癌細胞診断と選択的光熱療法を示しました[19]。 Jokerst etal。アスペクト比が約3.5の金NRとシリカ被覆金NRを開発しました。これは、卵巣がんの検出と間葉系幹細胞のイメージングに高いPAI信号を示しました[20、21]。ヤンと同僚は、二重磁気共鳴PAIと標的光熱療法のための磁性金ナノロッド/ PNIPAAmMAを報告しました[23]。多くのAuNRベースの造影剤が開発されていますが、大きくて調整可能なアスペクト比のAuNRの簡単でスケーラブルな合成と、それらの吸収挙動に依存するPAIパフォーマンスは依然として課題です。

ここで、アスペクト比が8.5から15.6のAuNRは、アスコルビン酸を利用した改良シード媒介成長法を使用して合成されています。 AuNRは、高い生体適合性を備えており、SH-PEG修飾により細胞毒性がさらに低下することが実証されました。 NIR領域での大きくて調整可能な吸光度の恩恵を受けて、合成されたAuNRは、invitroおよびinvivo実験の両方で、PAIでより強いコントラストとより高い信号対雑音比（SNR）値を提供できます。調整可能なアスペクト比の金NRを構築するためのこの簡単な方法は、最初のNIRウィンドウで任意の波長の下で造影剤を製造するために利用できます。

実験的

金ナノロッドの合成

調整可能なアスペクト比のAuNRは、修正されたシードを介した合成方法によって合成されました[16、17]。通常の手順では、10.3mLの0.025M HAuCl ₄ を使用します。 （Sinopharm Chemical Reagent Co.、Ltd.、≥99.9％）および3.644 gの臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB）界面活性剤（Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute、≥99.0％）を最初にビーカーに追加しました。次に、脱イオン水（18MΩ）を追加して、HAuCl ₄ の濃度にしました。 2.5×10 ^-3 になります M、および0.1 MのCTAB。上記の溶液の10mL、4.5 mL、4.5 mL、および45 mLを、A、B、C、およびDのタグが付けられた4つのフラスコに別々に移しました。次に、350μLの容量を入れます。 、0.01M氷冷NaBH ₄ （Sinopharm Chemical Reagent Co.、Ltd.、≥98.0％）をフラスコAに加え、3分間撹拌しました。フラスコAの0.4mL溶液と25μLの0.1M L（+）-アスコルビン酸（AA）（Tianjin Shentai Chemical Industry Co.、Ltd.、≥99.7％）をフラスコBに移し、さらに3分間撹拌しました。次に、フラスコBの0.4mL溶液と0.1MAAの25μLをフラスコCに加え、再度3分間撹拌しました。最後に、フラスコCの4mL溶液と0.1MAAの250μLをフラスコDに加え、5秒間撹拌した後、28°Cの水浴に12時間静置しました。上部の溶液を注意深く除去し、沈殿物を遠心分離し、蒸留水で数回洗浄して、過剰のCTABが完全に除去されたことを確認しました。したがって、最終製品は、Auの典型的なナノロッド（AuTR）として署名されました。

上記のプロセスを繰り返し、AAのドーズ量を変更するだけで、アスペクト比が8.5から15.6のAuNRを開発できます。詳細は次のとおりです。AAの投与量は、Au rod1の場合は（35 µL、35 µL、350 µL）、Au rod2の場合は（30 µL、30 µL、300 µL）、 Au rod3、および（15 µL、15 µL、150 µL）Aurod4の場合。

AuNRの表面修正

まず、10 mgのSH-PEG（Nanjing Pengsheng Biological Technology Co. Ltd）を1 mLの脱イオン水に溶解し、10分間超音波処理しました。次に、溶液を50 mL 0.1 M NaBH ₄ で処理しました。 溶液をさらに15分間超音波処理して、二量体化した可能性のあるSH-PEG（PEG-S-S-PEG）を減らします。次に、クリーンアップしたAuNRを10mLの脱イオン水に分散させ、上記のSH-PEG溶液（10 ml）に混合し、5分間撹拌した後、5時間静置しました。最後に、サンプルを遠心分離し、さらに適用するために脱イオン水で洗浄しました。

特性評価方法

合成されたAuNRの形態と構造は、走査型電子顕微鏡（SEM; JEOL JSM-7001F）と透過型電子顕微鏡（TEM; JEOL 2100F、200 kV）によって特定されました。様々なAuNRのUV-vis吸光度を分光光度計（島津製作所、3100 UV-vis-NIR）で測定しました。光音響信号は、レーザー装置（Surelite I-20、Continuum）、光パラメトリック発振器（OPO）（Surelite OPO Plus）、非集束超音波トランスデューサー（PMUT）（V310- SU、オリンパス、5 Hz）、モーターステップ回転テーブルとそのモーターコントロールボックス（MC）（M600、Beijing Zolix Instrument Co.、Ltd。）、プリアンプ（5077PR、オリンパス）、PCI4732データ取得（DAQ）カードなどオン。

細胞生存率実験

すべての生物実験手順は、太原理工大学のIACUC委員会によって承認されました。そして、実験は承認されたガイドラインに従って実施されました。

Hela細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）が推奨する標準細胞培地で、37°C​​、5％CO ₂ で培養されました。 雰囲気。 96ウェルプレートに播種した細胞を、さまざまな濃度のAuNRおよびAuNR-PEGとともに24時間インキュベートしました。相対的な細胞生存率は、標準的なメチルチアゾリルテトラゾリウム（MTT）アッセイによって決定され、光学顕微鏡で画像化されました。

InVitroおよびInVivo PAI

2グラムの寒天粉末（Gene Company Ltd.）を100 mLの脱イオン水に溶解し、ビーカー内のガラス棒でよく混合しました。濁った液体を電子レンジ（Midea Group Limited by Share Ltd.）で加熱して沸騰させた。その後、液体を取り出し、水浴中で60℃で20分間、液体が濃くなるまで撹拌した。次に、粘性のある材料を直径4.5 cmの円筒型に流し込み、冷却して固化しました。最後に、凝固した寒天は、NIRレーザーに対するおおよその吸光度のため、生体組織のファントムとして使用されました。

直径0.9mmのガラス毛細血管をファントムの表面に移植して、血管をシミュレートしました。血管は、新鮮な牛の血液、または特定の実験でさまざまな濃度のAuNR-PEGと混合された血液で満たされます。ファントムを水中に置き、680nmまたは800nmのレーザーを、出力密度11 mJ / cm ² で照射しました。 。

イソフルランでマウスを一時的に麻酔し、0.04 mL / 10 g 10 wt％抱水クロラールを腹腔内注射して、マウスを完全に麻酔しました。マウスの頭の毛をそっと剃り、超音波カップリング剤（Boline Healthcare Ltd.）を滑らかに塗りました。レーザーの波長を800nmに調整し、マウスを水中に置きました。次に、マウスの脳血管を前後に画像化し、造影剤（1 nM、0.1 mL / 10 g）をマウスに静脈内（I.V）注射しました。レーザーを680nmに変更し、上記の実験を繰り返します。注：造影剤を変更した場合、残留物が完全に代謝されるまで、少なくとも24時間後に点滴注射を行う必要があります。

結果と考察

AuTRの典型的な形態と構造は、TEMによって体系的に議論されています（図1）。図1aに示すように、合成されたAuTR（AAの投与量は25μL）は形状が均一で、直径は22±1.5 nm、長さは290±13 nm、アスペクト比は約13.2です。図1bは、いくつかの代表的なAuTRの高倍率TEM画像を示しています。単一のナノロッドの端部領域（図1bの「1」の長方形の領域）の高分解能TEM（HRTEM）画像を図1cに示します。その結果は、ナノロッドの長軸に垂直な格子縞が、（110）格子面に対応する1.44Åのd間隔で識別できることを示しています。ナノロッドは、選択領域電子回折（SAED）パターンとHRTEM画像の分析からAuの立方構造によって決定されるように[110]方向に沿って成長します[16、17]。図1dのAuTRのUV-vis吸収スペクトルは、2つの吸収ピークを示しています。特徴的なピークは約520 nmで、縦方向のピークは約900nmです。 HS-PEG（赤い線）で機能化すると、吸収帯はピーク強度でわずかな低下（約5％）を示しますが、ピーク位置での明らかなシフトはありません。

25μL0.1MAA（AuTR）で合成されたAuナノロッドの典型的な形態と構造： a 明視野TEM画像。 b 単一ロッドの増幅TEM画像。 c パネル b からの長方形領域「1」の単一ロッドのHRTEM画像 。 d AuTRおよびAuTR-PEGのUV-vis吸収スペクトル

モノマー濃度と結晶成長速度の速度論的制御が、異方性成長から開始される材料形状だけでなく、粒子サイズを操作するための重要な要因であることはよく知られています[24、25]。したがって、この作業では、濃度依存の実験を実行して、AuNRの異方性成長に対するAAの影響を調査しました。 AAの使用量が35μL（0.1 M）の場合、合成されたAuNRのアスペクト比は約8.5±0.6です（図2a、アスペクト比の数学的統計のために約50の個別のAuNRがランダムに選択されました）。 AAの投与量を35から15μLに減らすと、AuNRのアスペクト比は8.5から15.6に増加します（図2a–d）。一般に、AAは、淡黄色のAu ³⁺ を還元するための還元剤としてよく使用されます。 Au ⁺ へ そして、Au ⁰ の形成を誘発することができませんでした ナノ粒子[26、27]。しかし、私たちの実験では、合成されたAuNRのアスペクト比はAAの濃度によって異なります。 AAは還元剤として機能するだけでなく、実験でAuNRの異方性成長の調節を支援するキャッピング剤の役割も果たしていると考えられます[28、29、30]。反応系のAA濃度の低下に伴い、Au ⁺ イオンは放出を加速し、Auナノロッドの縦軸に沿って急速な成長を誘発するように結合されています（図2e）。図2fは、すべてのサンプルのUV-vis吸収スペクトルを示しています。アスペクト比が8.5から15.6に増加すると、AuNRの赤色の強い縦方向SPR吸収帯は〜680から1100 nmにシフトし、広いNIR範囲をカバーし（図2f）、生物医学的応用の大きな可能性を示しています[31、32 ]。

さまざまなAA投与量のAuNRの形態とアスペクト比の統計： a–d SEMとヒストグラム、 a Rod1、 b Rod2、 c Rod3、および d Rod4。 e アスペクト比に対応するAA線量の折れ線グラフ。 f さまざまなAuNRのUV-vis吸収スペクトル

AuNRのinvitro光音響特性を図3に示します。HS-PEGで機能化されたAuNRの光音響（PA）振幅は、0.25〜1.0 nMの一連の光学成分濃度で測定されました（図3a）。良好な線形関係を示した。 AuTRは、800nmレーザーと680nmのAurod1によって照射されたPA信号を大幅に強化します。レーザー波長の調整が不十分な場合（たとえば、680nmのAuTRと800nmのAurod1）、PA信号の強度が急激に弱まりました。図3bは、新鮮な牛の血液、または1 nMAuTRとAuロッド1を混合した血液バランスで満たされたガラス毛細血管のPA画像を示しています。その結果は、b3（800 nmのAuTR）とb7（680nmのAurod1）の方が優れたイメージング効果があることを示しています。明らかに、適切な造影剤は、PAIでより強い吸収を提供し、PA画像のより高い解像度をもたらす可能性があります。図3c、dは、純粋な血液と、AuTRおよびrod1を混合した血液との間の光音響信号の定量的比較を示しています。その結果は、AuTRと混合された血液の光音響信号振幅が800 nmで純粋な新鮮な牛の血液より2.3倍高く、Aurod1グループが680nmで2.1倍高いことを示しています。大きな増強は、それらの縦方向の吸収ピークの位置に現れます。言い換えれば、AuNRの吸収挙動がPAIのパフォーマンスを支配します。

AuTRおよびAuNRのinvitro光音響特性： a それぞれ800nmおよび680nmのレーザーで照射されたAuTRおよびAurod1の濃度依存の光音響信号強度 b ガラス毛細管のPAIは、800nmおよび680nmのレーザーで照射された1nMAuTRまたはAurod1と混合された血液バランスで満たされます。 c 、 d 純血と、800nmおよび680nmのレーザーで照射された1nMAuTRまたはAurod1と混合された血液バランスとの光音響信号振幅の比較 e1 – e6 多波長光音響信号振幅（データポイント）から得られた5種類の合成AuNRと新鮮なオックスブラッドの吸収スペクトル（実線）の比較

5種類のAuNRと血液の光音響および光学スペクトルを図3e1〜e6に示します。多波長光音響信号スペクトルは、さまざまな波長（680〜900 nm）のレーザーで光音響信号の振幅を収集することによって取得され、1nMの水溶液がガラス毛細管で満たされました。明らかに、グラフは、AuNRの光音響信号スペクトルと光​​スペクトルがよく一致していることを示しています。これらの結果は、適切な波長のレーザーの下でPAIにAuNRを適用する可能性を明確に示しており、680〜900nmのさまざまな波長でAuNRの光音響効果を定量的に示しています。

アクティブターゲティングでのAuNRの生物毒性を調べるために、Hela細胞を0.25〜1.0nMの濃度のAuTRとインキュベートしました。細胞の生存率を測定するために、標準的なMTTアッセイを実施しました（図4a）。その結果は、AuTR-PEGの組み合わせが、24時間以内に他のグループと比較して、最大の細胞生存率（1 nMで95.3％）を誘発することを確認しています。これは、AuNR-PEGが低い細胞毒性と良好な生体適合性[33、34]を持ち、おそらく有望な光音響造影剤を持っていることを示唆しています。純粋なAuTRには重大な毒性はありませんでしたが（細胞生存率は1 nMで71.2％になる可能性があります）、細胞死は0.75および1.0 nMの濃度で現れ（図4b）、低濃度のAuTRが光音響に適していることを示しています高濃度は細胞死を誘発する可能性がありますが、イメージング[35、36]。したがって、AuNRの光音響増強効果と生物毒性の両方を考慮するために、1nMの濃度がinvivoPAIの適切な条件として選択されました。

24時間以内にPEGを修飾した場合としない場合のさまざまな濃度のAuTRとインキュベートした後のHela細胞の相対生存率： a 相対的な細胞生存率と b のヒストグラム Hela細胞の光学顕微鏡画像

光音響イメージングは​​、他の従来の光学イメージング法と比較して、生体内でのイメージング深度と空間分解能を向上させる非侵襲的イメージングモダリティです[37、38、39、40]。 NIR吸光度の高いAuNR-PEGは、光音響イメージングの優れたコントラスト剤として使用できることがわかりました（図5）。図5aは、in vivoPAI標本として選択されたマウスの脳血管の写真を示しています。図5b1–b6は、それぞれ800nmと680nmの波長のレーザーで、AuNR-PEG添加剤を使用した場合と使用しない場合の標本のマウス脳血管の光音響画像を示しています。その結果は、AuNR-PEG注射前は、対照群のPA画像（図5b1、b4）には主な脳血管の形状が大まかにしかなく、一部の分枝血管が背景に混ざっていて区別が難しいことを示しています。 、使用するレーザーの波長に関係なく。造影剤（AuTR-PEGおよびAu rod1-PEG）を注入すると、PA画像の品質が大幅に向上し、脳の一部の消失した細枝血管（対照群）、特に画像がはっきりと現れます。 800nmでキャプチャされたAuTR-PEGと680nmでキャプチャされたAurod1-PEGの比較。

マウスの脳血管の写真とPA画像： a マウス脳血管の写真、 b 800nmおよび680nmの波長のレーザーを照射したAuTRまたはAurod1の静脈内注射前後のマウス脳血管のPA画像スキーム

図5b1〜b6の光音響画像も、コントラストと信号対雑音比（SNR）の観点から定量的に分析されました（表1）。すべてのピクセルに対応する画像全体の平均コントラストは、マウスの脳血管の同じ位置でランダムに選択された10ポイントから計算されました。対照群の画像の平均コントラストは、図5b1では1.113、図5b4では1.076です。 AuNR-PEGを注入した後、すべての画像の品質がさまざまな程度で向上します。 AuTR / 800 nmグループでは、大動脈がはっきりと観察でき（図5b2）、平均コントラストは最大3.451に達し、コントロールグループの3.1倍に達する可能性があります。 Au rod1 / 800 nmグループとの並行比較（図5b3）では、平均コントラストはわずか1.514であり、コントロールグループの1.36倍です。ただし、レーザーの波長が680 nmに変更された場合、AuTRのコントラストはわずか1.925であり、Au rod1のコントラストよりもはるかに低くなっています（3.692、コントロールグループの3.6倍）。 AuTRグループの画像のSNRは、コントロールグループに対して800 nmで5.6倍最適化されており、Aurod1グループも680nmで5.7倍に強化されています。これらの結果は、基本的にin vitroの結果と一致しています。つまり、画質の大幅な向上は、それぞれの大きな縦方向の吸収ピークに起因する可能性があります。

結論

アスコルビン酸の助けを借りて、8.5から15.6の範囲の調整可能なアスペクト比の金ナノロッドが、改良されたシード媒介合成法によって合成されました。これらの金ナノロッドは、680〜1100 nmの調整可能な吸収ピークを提供し、最初の生物学的NIRウィンドウをカバーします。 SH-PEGで修飾すると、合成されたAuNRは優れた生体適合性と安定性を示し、光音響造影剤としての近赤外アプリケーションの大きな可能性を予見します。 invitroおよびinvivoの両方の実験により、合成された調整可能なアスペクト比のAuNRは、適切な波長のレーザーの下で、PAIでより強いコントラストとより高いSNR値を提供できることが確認されています。この作業は、最初のNIRウィンドウで任意の波長の下で造影剤を制御可能に合成し、脳内出血や血栓などの疾患を視覚化するために使用される可能性のある方法を提供します。

略語

1D：

一次元

AA：

l（+）-アスコルビン酸

AuNR：

Auナノロッド

AuTR：

Auの典型的なナノロッド

CTAB：

セチルトリメチルアンモニウムブロミド

DNA：

デオキシリボ核酸

MTT：

メチルチアゾリルテトラゾリウム

NIR：

近赤外線

NR：

ナノロッド

OPO：

光パラメトリック発振器

PA：

光音響

PAI：

光音響イメージング

SAED：

選択領域電子回折

SEM：

走査型電子顕微鏡

SH-PEG：

チオール-ポリエチレングリコール

SNR：

信号対雑音比

SPR：

表面プラズモン共鳴

TEM：

透過型電子顕微鏡