転移性乳癌の超音波イメージングと相乗的治療を統合するための低強度集束超音波増強多機能ナノ粒子

はじめに

乳がんは、最も脅威的な悪性腫瘍の1つとして、何年にもわたって女性を悩ませてきました。高い不均一性と高い転移能により、乳がんの遠隔転移が死亡率の90％以上を占めたのに対し、進行または転移した患者の5年生存率はわずか26％であり、結果として臨床転帰不良[1,2,3]。乳がんの否定的な特徴は、完全に治癒することを困難にし、治療戦略を促進して、原発腫瘍と遠隔転移を排除することをより困難にしています。

手術や化学療法などの従来の治療アプローチは、依然として乳がんの治療に効果的であると考えられています[4]。すべての化学療法薬の中で、ドセタキセル（DTX）は、転移性乳がん（MBC）および進行性乳がん（ABC）の治療に重要な役割を果たしています[5]。イチイの木の化学物質によって合成される一次抗腫瘍薬として、DTXの抗腫瘍効果は主に有糸分裂と細胞増殖を破壊することによって達成されます[6]。 DTXは、その広範な抗腫瘍効率を備えており、乳がんの治療において最も効果的な化学療法剤の1つになりつつあります[7]。しかし、化学療法剤は通常、望ましくない効果と全身毒性を誘発し、治療効率を大幅に制限します[8]。さらに、さまざまな臨床病期とさまざまな個人的状態は、単一の治療アプローチが乳がん治療のすべての期待に応えるのに十分効率的ではない可能性があることを明らかにしています。したがって、将来のアプリケーション要件では、有毒な副作用を抑制し、DTXの治療効果を高めることが急務です。

超音波は、放射線のない、非侵襲性、費用対効果などの並外れた利点のために、臨床診断で最初に検討されました[9、10]。上記のユニークな特徴にもかかわらず、ナノ構造材料に基づく治療の展望においても多くの注目を集めています[11]。ソノダイナミック療法は当初、超音波によって引き起こされるキャビテーションと「ソノポレーション効果」によって実現されました。このプロセス中にROSが生成されると、癌細胞に対する細胞毒性が効果的に誘発され、腫瘍細胞の急速なDNA損傷とアポトーシスが引き起こされます[9]。光線力学療法（PDT）の表面的な使用とは異なり、SDTは、治療中の望ましくない熱傷を防ぐメリットがある低強度集束超音波（LIFU）による深部腫瘍の治療において、より快適な治療結果を受け取ります[12、13]。 SDTの必需品の1つとして、超音波増感剤はさまざまな腫瘍治療で研究されてきました[14]。塩素e6（Ce6）はもともと一般的な光増感剤として使用されていましたが、その望ましい治療能力と腫瘍組織への優れた親和性により、超音波増感剤としても適用できるようになりました[15]。塩素ファミリーの第2世代としてプレイされているCe6は、その望ましいROS生成のために腫瘍治療で大きな注目を集めています[16]。ただし、Ce6を1回適用するだけで、常に不安定性と望ましくない皮膚毒性が引き起こされ、SDTの広範な調査が制限されています。

近年、ナノテクノロジーの開発は、バイオセンシング、環境汚染、汚染物質の分解など、多くの分野で非常に重要な役割を果たしてきました[17、18、19、20、21、22、23]。ナノテクノロジーベースのナノ粒子には、直径が小さく、外部表面積が大きく、内部拡散抵抗が低いなど、多くの利点があります[24]。以前は、ナノ粒子はMOF [25]、二酸化チタン[26]、グラフェン[21]などのさまざまな材料の応用に関与してきました。癌治療と組み合わせたナノテクノロジーの急速に成長している傾向も広く調査されており、組み合わせた治療戦略を促進するための実行可能な道を開いています[27]。効果的な腫瘍治療への応用を実現するために、繊細に設計されたナノ粒子は、主に強化された透過性と保持（EPR）効果によって毒性化学療法剤の輸送効率を改善し、腫瘍部位への蓄積を増加させるように設定されています[28、29]。さらに、化学療法をカプセル化することにより、望ましくない副作用を減らすこともできます。パーフルオロペンタン（PFP）は、照射下で液相から気相に変換する優れた能力を備えていることが報告されており、特に超音波イメージングおよび治療において、新しい超音波分子プローブとして適用できます[30]。さらに重要なことに、初期の液相により、PFPをさまざまな材料に容易にカプセル化することができます[31]。さらに、PFPのカプセル化は、上記のEPR効果に従って腫瘍部位での超音波イメージング機能を大幅に改善し、より大きなマイクロメートルサイズのマイクロバブルによって引き起こされるサイズ制限を回避できます。腫瘍イメージングを除いて、複数の治療アプローチの組み合わせは、ナノシステム指向の癌治療において非常に価値があります。具体的には、ソノダイナミック療法と化学療法の統合を含む実践は、従来の治療効率に革命をもたらすことに重点を置いてきました。 Xu etal。 [32]は、SDTにより、化学療法薬で治療結果の向上が明らかになり、ミトコンドリアを標的とした腫瘍細胞のアポトーシスの活性化につながる可能性があることを示しました。このパターンは、将来の利用に非常に懸念されている相乗的治療を明らかにします。

ここでは、上記のインスピレーションを受けて、オールインワンナノ粒子（CPDP NP）を活用して、化学療法と組み合わせたSDT指向の相乗的治療、および強化された診断および治療システムを確立することを意図しています。超音波イメージング。 PLGAは、望ましいナノキャリアとして優れた安全性と理想的な代謝安定性を備えており、さまざまな抗腫瘍能力の探索に有利になっています[33、34]。したがって、この戦略では、外層材料としてPLGAを使用すると、PFPはLIFUによってトリガーされる位相シフト機能によって超音波イメージングを大幅に強化でき、望ましい第2世代の超音波増感剤であるCe6もLIFUに曝露してROS生成を誘導できます。さらに、DTXの放出を伴い、化学療法とSDTの両方が実現され、最終的に相乗的な治療を実現します。重要なことに、CPDP NPのコアシェル構造は、正常な組織や細胞を傷つけることなく着実に投与でき、ナノ粒子のカプセル化効率を比較的高くすることもできます[35]。さらに、このコアシェル構造[36,37,38]では、特に構造が存在するために液体から気体に効果的に変換できるPFPの場合、内容物を十分に保護できます。このコアシェル構造を使用すると、相乗効果のある戦略をより安定した方法で同時に実証できます。第一に、相乗的戦略は、効果的なカプセル化によってDTXの副作用を大幅に軽減するのに役立ちます。これは、悪性および侵攻性の腫瘍の治療における苦痛を和らげるために非常に重要です。第二に、単一の化学療法と比較して、SDTと化学療法の組み合わせは治療効率を強化するための有望な戦略であることが確認されています。第三に、PFPによって実現された強化された超音波イメージングは​​、診断戦略を最適化し、抗腫瘍効果の検証にも役立ちました。最後になりましたが、システム全体が安全で安定しており、優れた生体適合性を備えています。この戦略では、肺転移と腫瘍増殖がinvitroとinvivoの両方で著しく阻害されていることが強調されています。結論として、相乗的戦略は、乳房の悪性腫瘍とその遠隔転移に対する生産的な治療効果を示し、その超音波画像診断機能と組み合わせることで、さらなる臨床応用における有望な治療戦略になる可能性があります。

材料と方法

資料

PLGA-COOH（Mw 12,000 Da）は、Jinan Daigang Biomaterial Co.、Ltd（中国、済南）から購入しました。パーフルオロペンタン（PFP）とアガロースは、Sigma-Aldrich Co.、Ltd。（ミズーリ州、セントルイス）から入手しました。クロリンe6（Ce6）は、Melone Pharmaceutical Co.、Ltd。（大連、中国）から購入しました。 Cell Counting Kit-8（CCK-8）細胞毒性アッセイキットは、Dojindo Molecular Technologies（Tokyo、Japan）から入手しました。 2 '、7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（H2DCFDA）は、MedChemExpress Co.、Ltd。（NJ、USA）から購入しました。ヨウ化プロピジウム（PI）は、Solarbio Science and Technology Co. Ltd.（北京、中国）から入手しました。アネキシンV-FITC / PIは、BD Biosciences（USA）から入手しました。ドセタキセル（DTX）は、MedChemExpress Co.、Ltd。（NJ、USA）から購入しました。他のすべての試薬は、さらに精製することなく分析用の純粋な生成物でした。 Roswell Park Memorial Institute 1640培地（DMEM）、ウシ胎児血清、およびチリシンは、Gibco（ThermoFisher Scientific、米国）およびUV分光光度計（UV–Vis、日立、日本）から購入しました。

CPDPNPの合成

Ce6-PFP-DTX / PLGAナノ粒子（CPDP NP）は、以前の報告[39、40]に従ってW / O / Wダブルエマルジョン法によって調製されました。簡単に説明すると、2mgのCe6を最初に500μLのメタノールに溶解しました。次に、50mgのPLGA-COOHとドセタキセル（2 mg）を4 mLのジクロロメタンに溶解し、前の溶液を同時に加えました。次に、200μLのPFPを上記の溶液に加えました。その結果、混合物は超音波プローブ（Sonics＆Materials Inc.、USA）によってトリガーされ、最初のエマルジョンが得られました（5秒オンと5秒オフ、3分）。 2番目のエマルジョンを取得するために、同じ超音波プローブを2分間使用して、8 mLのポリ（ビニルアルコール）（PVA）溶液（w / v =4％）を上記のエマルジョンに添加しました。最終的なエマルジョンに10mLの2％イソプロピルアルコールを加えた後、溶液を室温で少なくとも4時間機械的に混合して、ジクロロメタンを完全に揮発させました。最後に、CPDP NPを3回遠心分離し（12,000 rpm、5分）、収集してさらに使用するために4°Cで保存しました。 ＰＤＰ ＮＰは、Ｃｅ６を除いて同じ方法で調製された。すべての実験プロセスは氷上で行われ、厳密に暗闇で実施されました。

CPDPNPの特性評価

CPDPNPとPDPNPの粒子サイズとゼータ電位は、Malvern Zetasizer Nano装置（Malvern、UK）によって実現されました。形態は、透過型電子顕微鏡法（TEM）と光学顕微鏡法によって特徴づけられました。安定性を評価するために、CPDP NPをリン酸緩衝液（PBS）に溶解し、それぞれ7日間のサイズを測定しました。各サンプルは3回測定されました。 CPDP NPのカプセル化効率は、次の式で計算されました。

カプセル化効率（％）=（DTXまたはCe6をロードする重量/ DTXまたはCe6の合計の重量）×100％。さまざまな材料のカプセル化を検証するために、さまざまなサンプルのUV-Visスペクトルを調査しました（UH5300、日立）。効果的なカプセル化もTEMによって分析されました。

CPDPNPの薬物放出率

CPDP NPにおけるCe6およびDTXの薬物放出能力を評価するために、異なるpHの2つの溶液（リン酸緩衝液、PBS：7.4、酢酸緩衝液、ABS：5.6）を使用して、累積放出効率をテストしました。簡単に説明すると、CPDP NPは、混合物を透析バッグ（Mw：10,000）に密封した後、最初に1mLのPBSまたはABSで分散させました。次に、溶液全体をガラス瓶（総量：150 mL）に移し、そこに149 mLのPBSまたはABSを加えて、総溶液量を150mLに維持しました。次に、ガラス瓶を37°Cの恒温振とう機に入れ、さまざまな期間（0.5、1、2、4、8、12、24、48、72時間）で溶液を収集し、すぐに同じものを補充しました。培地の量。各グループは3回繰り返されました。最後に、Ce6とDTXの濃度をSynergy Hybrid Multi-Mode Read（BioTek、USA）によってそれぞれ403nmと229nmで測定し、各時点での薬物放出率を計算しました。

インビトロ超音波イメージング

CPDP NPの超音波機能を調査するために、エマルジョン（1 mg / mL）は、最初に低強度集束超音波（LIFU）トランスデューサー装置（Ronghai Ultrasonic Medical Engineering Research Center、重慶、中国）によってトリガーされ、伝導パターンは50％のデューティサイクル、さまざまな強度（1〜2 W / cm ² での1秒のパルス持続時間）として設定 ）さまざまな期間。超音波イメージングの場合、照射されたCPDP NPは、Philips EPIQ5超音波診断装置（プローブ周波数：12 MHz、MI：0.06）を使用して、以前に準備されたアガロースモデルにそれぞれ追加され、CPDPNPの2DおよびCEUSイメージングの両方を観察しました。一方、ImageJソフトウェアを適用して、各グループのグレースケール値を分析しました。

LIFU照射によるCPDPNPの細胞取り込みとinvitroROS生成

マウス乳がん細胞株4T1は、中国科学院（上海、中国）の上海細胞バンクから入手し、10％FBSおよび1％ストレプトマイシン/ペニシリンを混合したRPMI 1640培地で、37°C​​、5％COで培養しました。 ₂ 加湿インキュベーター。

4T1細胞は、最初に前の条件として1×10 ⁴ の密度でインキュベートされました。 さまざまな時間間隔（1時間、2時間、4時間、8時間）でCLSMを使用して細胞の取り込みをテストするためのディッシュあたりの細胞数。 ROSの生成を確認するために、細胞を次の5つのグループに分けました：コントロール、CPDP NP、LIFU、Ce6 + LIFU、CPDP NP + LIFU。従来の24時間培養後、培地をCPDP NP（200μL、0.8 mg / mL）またはCe6溶液（200μL）にそれぞれ交換し、細胞をさらに3時間共培養しました。次に、LIFU照射（2 W / cm ² 、120 s）は、さまざまなグループに応じてそれぞれ実施されました。共培養とLIFU処理の後、100μLの希釈DCFH-DA溶液を添加し、各グループを前のインキュベーターで15分間培養しました。共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）を使用して、活性酸素種の生成結果を確認し、対応する蛍光強度をImageJソフトウェアで測定しました。

CPDPNPのinvitro細胞毒性と協調治療能力

CCK-8アッセイは、CPDPNPの細胞毒性を評価するために適用されました。簡単に説明すると、4T1マウス乳がん細胞を96ウェルプレートで1×10 ⁴ の密度でインキュベートしました。 ウェルあたり24時間。次に、CPDP NPを、さまざまな濃度（0,0.2,0.4,0.6,0.8 mg / mL、 n ）の無血清RPMI1640培地で希釈しました。 =3）、LIFU照射ありまたはなし（2 W / cm ² 、120秒）。さらに24時間の共培養プロセスの後、4T1細胞の細胞生存率を測定しました。

協調処理の細胞アポトーシス効率を評価するために、4T1細胞を以前と同様に24時間共培養し、次の5つのグループに分けました：（1）コントロール（処理なし）、（2）LIFU（2 W / cmでのLIFU曝露のみ） ² ）、（3）CPDP NP（0.8 mg / mLのCPDPNP溶液のみ）、（4）PDP NP + LIFU、および（5）CPDP NP + LIFU。さまざまなナノ粒子の共培養（200μL）とLIFU曝露の後、各グループをアネキシンV（5μL）とヨウ化プロピジウム（5μL）の二重染色で20分間処理し、フローサイトメトリープロトコルで分析しました。

細胞転移のinvitro阻害

細胞転移能の阻害を調査するために、創傷治癒アッセイおよびトランスウェルアッセイを設計した。創傷治癒アッセイでは、4T1細胞を従来のように6ウェルプレートで培養しました。細胞が80％の集密度まで増殖した後、ピペットチップ（10μL）を適用して、6ウェルプレートの中央に沿って人工的な引っかき傷を付けました。次に、細胞を上記と同じグループで処理した。 24時間継続的に共培養した後、細胞をPBSで3回洗浄し、光学顕微鏡（オリンパス、日本）で観察しました。

トランスウェルアッセイでは、トランスウェルチャンバーの上部コンパートメント（コーニング、サンディエゴ、米国）を主に適用して、invivoで細胞外マトリックスを模倣しました。 1×10 ⁵ の密度の4T1セル ウェルあたりの細胞を無血清RPMI1640培地の上部チャンバーに播種し、下部コンパートメントに10％FBSを混合した完全培地を充填しました。次に、上記のグループと同じように細胞を分離し、それぞれ24時間処理しました。その後、底面の細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、クリスタルバイオレットで染色した。結果は光学顕微鏡（オリンパス、日本）で観察されました。

InVivo超音波イメージング

健康な雌のBALB / cマウス（4週間）と昆明マウス（4週間）は、寧夏医科大学実験動物センターから入手しました。すべての動物実験は、寧夏医科大学の動物福祉倫理審査委員会によって承認されたガイドラインの下で実施されました。マウスの担癌モデルを確立するために、BALB / cマウスに4T1乳がん細胞（1×10 ⁷ ）を接種しました。 / mL）右側腹部。腫瘍のサイズが60〜80mmに拡大した後 ³ 、BALB / cマウスにCPDPNP（200μL、1 mg / mL）を尾静脈から静脈内注射しました。 24時間後、マウスの腫瘍部位をLIFU（2 W / cm ² ）で実施しました。 、120秒）、その後、2DおよびCEUSイメージングは​​、前述のPhilipsEPIQ5超音波診断装置を介して取得されました。グレースケール分析は、ImageJソフトウェアによって測定されました。

CPDPNPのinvivo相乗的治療効率

4T1がん細胞の接種後、腫瘍のサイズを2日ごとに記録し、腫瘍の体積を次の式で計算しました。体積=1/2×長さ×幅 ² 。腫瘍の大きさとマウスの体重は2日ごとに記録され、腫瘍の成長の写真は3日ごとに記録されました。腫瘍体積が60〜80mmに達したとき ³ 、同様の腫瘍サイズのマウスをランダムに同じ5つのグループに分けました：コントロール、LIFU、CPDP NP、PDP + LIFU、およびCPDP NP + LIFU（ n =3）。対照群（代わりに200μLPBS）を除いて、各群に尾静脈からさまざまなNP（200μL）を静脈内注射しました。 24時間後、腫瘍部位をLIFU照射（2 W / cm ² ）で照射しました。 ）120秒間。 SDTの投与全体が3日ごとに繰り返され、18日間続きました。マウスの体重と腫瘍体積を測定し、計算した。治療後、マウスを殺し、腫瘍組織をH＆E、TUNEL、PCNAに送ってさらに組織学的分析を行いました。

InVivoでのCPDPNPのバイオセーフティ

インビボでのCPDPナノ粒子の生物学的安全性を調査するために、健康な雌の昆明マウス（ n =3）は、コントロール、5 mg / mL、10 mg / mL、および20 mg / mLの4つのグループに分けられました。 CPDP NP（200μL）をマウスの尾静脈から注射しました。その後、マウスはそれ以上の投与なしで食物と水に自由にアクセスできた。マウスの体重は2日ごとに測定されました。 30日後、マウスを殺し、血球および生化学分析のために血液サンプルを収集しました。主要な臓器（心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓）を収集し、H＆E染色についてそれぞれ調査しました。

肺転移のinvivo阻害

各グループの肺転移抑制を評価するために、肺の転移性結節の数を観察し、H＆E染色組織学評価を行うことにより、プロセス全体を実施しました。すべてのマウスを安楽死させた後、肺組織を取り出して固定した。次に、がんの結節の写真を撮り、肺組織をH＆E染色でさらに分析しました。

統計分析

測定データはすべて3回実行され、平均±標準偏差（SD）として表され、一元配置分散分析または標準学生の t によって分析されました。 p を使用して、SPSSソフトウェア（バージョン：19.0）でテストします。 値<0.05は統計的に有意であると見なされました。

結果

CPDPNPの特性評価と薬物放出効率

ダブルエマルジョン法は、CPDP NPの製造に適用され、位相シフト材料PFP、超音波増感剤Ce6、および化学療法薬DTXの両方を同時にカプセル化しました。 PBSまたは脱イオン水に分散させると、溶液は薄い灰色の外観を示しました。 CPDP NPは、光学顕微鏡または透過型電子顕微鏡のどちらで観察しても、均一な球形と明確なコアシェル構造を示しました（図1a、b）。 CPDPNPとPDPNPの平均直径は249.5±77.46nmと246.6±81.01nmであり、平均表面ゼータ電位はそれぞれ-18.47±0.55mVと-3.987±0.66mVでした（図1c）。 CPDP NPのサイズは、EPR効果によって受動的に腫瘍部位に蓄積されることを保証しました[40]。 CPDPNPとPDPNPの電荷の違いは、主に負に帯電したCe6によるものです[41]。さらに、CPDP NPの負のゼータ電位は、血漿タンパク質吸着が低いことを示しており、ナノ粒子の相対的な安定性を確認しています。粒子サイズの分布は、7日間で249.5〜385.1 nmの範囲に維持され（図1e）、CPDPNPの相対的な安定性を示しています。標準曲線によると、DTXとCe6のカプセル化効率はそれぞれ83.84±1.39％と60.54±3.79％でした。

a TEM（スケールバー：500 nm）および b CPDP NPの光学顕微鏡画像（スケールバー：20μm）。 c サイズ分布と d PDPNPおよびCPDPNPのゼータ電位。 e 7日以内のCPDPNPのサイズ分布。 f Ce6と g の放出速度 さまざまな条件下（pH7.4およびpH5.6、 n ）でのDTXの放出速度 =3）。 h それぞれCe6、DTX、PFP / PLGA、CPDPNPのUV-Visスペクトル。 CPDP NPの矢印は、Ce6とDTXの特徴的なピークを示しており、両方の材料が効果的にカプセル化されていることを示しています。 i 2つのナノ粒子のTEM結果。 PFP / PLGAナノ粒子は、薄いシェルと丸いコアを示します（左）。 Ce6とDTXの両方をカプセル化したCPDPナノ粒子は、はるかに厚いシェルと楕円形のコアを示しています（右）

図1f、gに示されているCPDP NPからのCe6およびDTXの薬物放出効率として、pH 7.4に溶解したナノ粒子と比較してpH5.5でDTX放出指数のほぼ2倍の増加が記録されました。 DTXの割合は、酸性腫瘍の微小環境で効果的に達成できます。上記の結果はすべて、繊細に設計されたCPDP NPが酸性腫瘍環境で安定したタイムリーな化学療法薬の放出を発揮し、SDTの準備が基本的に望ましいことを示しています。

UV-Visが示すように、DTXとCe6は、それぞれ229nmと403nmに固有の吸収ピークを示しましたが、逆に、PFP / PLGAはピークを示しませんでした。 CPDP NPのスペクトルは、上記の2つの波長の近くで同様のピークを示し、残りはPFP / PLGAスペクトルの同じ傾向を示し、さまざまな材料のカプセル化が成功したことを示していることに注意してください（図1h）。効果的なカプセル化をさらに検証するために、図1iは、PFP / PLGAナノ粒子がはるかに薄いシェルと丸いコアを所有しているのに対し、CPDPナノ粒子は、DTXとCe6の両方がカプセル化されているため、比較的厚いシェルと楕円形のコアを示しています。

インビトロ超音波イメージング

PFPが優れた位相シフト能力を持っていることが強調されています。液体から気体への変換は、ナノ粒子が腫瘍部位内で凝集するのを助けるだけでなく、超音波イメージングの効率を高めるその能力を与えます[42]。それを実証するために、LIFU照射は、PFPの相変態、すなわち音響液滴気化（ADV）効果を誘発するトリガーとして適用されました[43]。その結果、LIFU照射前はグレースケール強度が比較的低いレベルに保たれ、LIFUの強度と照射時間が増加した後、2DとCEUSの両方で超音波イメージングが強化される傾向が明らかになりました（図2a）。 ImageJの音響分析は、グレースケール値の上昇によって結果をさらに確信させました（図2b、c）。これは、画像の結果と一致していました。 LIFU強度が2W / cm ² に達したときに得られた、2DとCEUSの最も重要な結果に注意する必要があります。 120秒間続きました。上記の結果は、PFPがCPDP NPに正常にカプセル化され、超音波イメージング機能がLIFU投与のより長い時間とより高い強度の下で大幅に促進されたことを示しています。

a 異なるLIFU強度と持続時間での2DとCEUSの両方の超音波画像。 b 2Dイメージングと c のさまざまな強度と時間での対応するグレースケール強度 CEUSイメージング（** p <0.01、 n =3）

LIFU照射によるCPDPNPの細胞取り込みとinvitroROS生成

CLSMの結果が図3に示したように、CPDP NPの細胞取り込みは、さまざまな時間間隔で増強された傾向を示し、8時間の共培養で最も有意な凝集に達しました。

さまざまな時間間隔でのCPDPNPの4T1細胞取り込み（青：DAPI染色された4T1細胞。赤：DiR標識CPDP NP、スケールバーは50μm）

ソノダイナミックセラピー（SDT）の主な戦略は、癌細胞のアポトーシスを誘導し、細胞増殖を阻害するための一連の単一電子還元生成物であるROSの生成です[44]。超音波にさらされると、超音波増感剤がROS産生を誘発する傾向があることが強調されています。その間、プロセス全体でかなりの量のエネルギーが放出されます[45]。超音波と超音波増感剤の両方がSDTを促進するために不可欠な要素であることを考えると、したがって、細胞内ROS生成は、分割されたグループ間の違いを調査するために設計および分析されました。図4aによると、遊離Ce6とLIFU照射グループによって生成されるROSの量はごくわずかでした。これは、遊離Ce6の急速な代謝が不十分なROS生成につながる可能性があるためです。それどころか、最も強い蛍光強度は、CPDP NPs + LIFUグループによって明らかにされました。カプセル化されたCe6は十分に保護されているため、代謝されないようになっていると想定されていました。結果として、LIFU刺激後、Ce6が放出され、豊富なROSが生成されました。比較すると、他のグループでは有意な蛍光シグナルは見つかりませんでした（図4b）。

a さまざまな処理と b を使用したROS生成のCLSM画像 対応するFL強度分析（**** p <0.0001、 n =3）。スケールバーは50μmです

CPDPNPのinvitro細胞毒性と協調治療能力

CPDPNPのinvitro細胞毒性をテストするために、Cell Counting Kit-8（CCK-8）アッセイが導入されました。この点で、異なるグループは、異なる濃度でのLIFU照射の有無にかかわらず設計されました。結果は、LIFU曝露なしで24時間の共培養後、最高濃度（0.8 mg / mL）でもCPDP NPの生存率の明らかな影響がないことを示し、CPDP NPの望ましいバイオセーフティを示しています（図。 5a）。対照的に、LIFU照射後の細胞生存率の著しい低下が見られ、CPDP NPとLIFUの組み合わせが4T1細胞死を著しく引き起こしたことを示しており、これはin vitroROS生成と一致していました。

a 異なるCPDPNP濃度下でのLIFU照射の有無による相対的な細胞生存率。 b フローサイトメトリーアッセイおよび c による4T1腫瘍細胞のアポトーシスと壊死 対応する壊死およびアポトーシス率分析のデータ（**** p <0.0001、*** p <0.001、 n =3）

SDTの有効性をさらに評価するために、フローサイトメトリーアッセイが導入されました。図5b、cに示すように、細胞の壊死とアポトーシスの指標はCPDP NPs + LIFUグループで最も高く観察されましたが、他のグループでは明らかな壊死とアポトーシスは見られませんでした。特に、CPDP NPs + LIFUグループの壊死およびアポトーシス率は、CPDP NPsのみのグループのそれよりも3倍高く、別の点からSDTの有意な腫瘍細胞死効率を保証しました。興味深いことに、PDP NPs + LIFUグループと比較して、CPDP NPs + LIFUグループの細胞壊死とアポトーシス率は有意に増加し、SDTと化学療法の相乗的な治療効率を示しました。

細胞転移のinvitro阻害

腫瘍細胞の浸潤および遊走能力は、腫瘍の進行に不可欠です[46、47]。図6aに示すように、CPDP NPs + LIFUグループの物理的ギャップ間の閉鎖は他のグループよりも大幅に広く、移行効率が比較的遅いことを示しています。 ImageJソフトウェア分析（図6c）によると、CPDP NPs + LIFUグループの移行率も他のグループと比較して著しく減少しました。

a 創傷治癒と b さまざまな処理後のトランスウェルアッセイ。 c 創傷治癒アッセイの対応する移動速度。 d トランウェルアッセイの対応する移動数（**** p <0.0001、 n =3）

同様に、トランスウェルアッセイでは、他のグループの迅速な移動速度と比較して、CPDP NPs + LIFUグループは細胞数の有意な減少を示し（図6b）、相乗的治療の優れた抗移動能力を示しました。具体的には、SDTがない場合（CPDP NPのみおよびLIFUのみのグループ）、腫瘍細胞の数はわずかに減少しました（図6d）。全体として、SDTと化学療法の組み合わせにより、4T1細胞の転移はinvitroで著しく抑制されました。

InVivo超音波イメージング

PFPはCPDPNPにカプセル化されているため、生体内で特徴的な超音波イメージング機能を評価することも必要です。 CPDP NPの尾静脈から注射した後、LIFUを腫瘍部位に適用して、2DとCEUSの両方の画像を取得しました（図7a）。 2つのグループ間の明確なグラフィックの違いは、LIFU照射後、CPDPNPの対応する強度が照射前のグループと比較して明らかに上昇したことを示しました。平均エコー強度のさらなるデータもこの結果を確認しました。これは以前のinvitroイメージング結果とも一致していました（図7b、c）。

a LIFU照射がある場合とない場合の2DおよびCEUS画像。 b 、 c ImageJによって測定された対応するグレースケール強度分析（** p <0.01、* p <0.05、 n =3）

CPDPNPのinvivo相乗的治療効率

図8a、bからわかるように、CPDP NPs + LIFUグループの腫瘍体積は、他のグループよりも18日間の治療後に有意に小さかった。これは、SDT治療と化学療法に由来するROSの有効性に起因する可能性がある。有効な相乗的治療効率。同様に、マウスを持った腫瘍の写真（図8a）も同じ傾向を示し、LIFU曝露によって引き起こされたCPDPNPの共同治療効果を検証しました。さらに、異なるグループ間でマウスの明らかな体重減少はありませんでした（図8c）。上記の結果はすべて、CPDP NPs + LIFUグループのはるかに高い阻害率を示しており、相乗的治療が腫瘍の成長を大幅に防ぐことができることを明らかにしています。

a 特定の18日以内にさまざまな治療を受けた担癌マウスの画像（ n =3）。 b さまざまな治療法による腫瘍体積分析（** p <0.01）。 c さまざまな治療下の担癌マウスの体重（ ns 重要性なし、 n =3）。 d H＆E、PCNA、TUNELは、さまざまな処理で得られます（スケールバー：200μm）。 e さまざまな治療下での腫瘍のPCNA増殖指数の分析。 fさまざまな治療下での腫瘍のTUNELアポトーシス指数の分析（**** p <0.0001、 n =3）

すべてのグループの治療結果をさらに証明するために、H＆E、PCNA、およびTUNEL染色の両方が利用されました（図8d）。 CPDP NPs + LIFU群におけるPCNAの増殖率はわずか20.50％であり、対照群より4倍低く、LIFUおよびCPDP NPsのみ群より3倍低く、PDP + LIFU群より2倍低く、有意な抗腫瘍を示した。増殖率（図8e）。図8d、fに示すように、TUNELの結果は、CPDP NPs + LIFUグループが72.86％の明らかなアポトーシス指数を示したことを示しています。これは、コントロール（9.66％）、LIFU（12.86％）、CPDP NPs（19.59 ％）、およびPDP NPs + LIFU（37.06％）グループ。上記の結果はすべて、in vivoで発揮される相乗的治療の有効性を示しており、これは以前のinvitroの結果とも一致していることが証明されました。

InVivoでのCPDPNPのバイオセーフティ

効果的な治療結果にもかかわらず、新規に確立されたナノ粒子の生物学的安全性を調査することも非常に重要です。インビボでのCPDPNPの安全な分布に代わって、代謝の安全性が実施された。結果は、明らかな体重減少の代わりに、マウスの体重がすべてのマウスグループで徐々に上昇したことを示し（図9a）、これはCPDPNPの無視できる負の影響を示しています。さらに、さまざまな臓器と血液サンプルが図9bに示されているように、異なる治療グループ間で血球、生化学分析指数、およびH＆E染色（図9c）に有意な変化は観察されず、CPDPNPの優れたバイオセーフティがインビボ。

a さまざまな濃度のCPDPNP（ n ）下での健康な昆明マウスの体重 =3）。 b 30日以内のさまざまな濃度のCPDPNPの下での血液生化学および血液ルーチン検査（ n =3）。 c 同じ治療（スケールバー：50μm）下のマウスのさまざまな臓器（心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓）のH＆E結果

肺転移のinvivo阻害

肺が乳がんの遠隔転移の主な標的臓器であることは十分に確立されています[48]。転移の抑制効率を評価するために、マウスの肺組織を抗転移研究に利用した。図10a、bからわかるように、コントロール、LIFU、CPDP NP、およびPDP + LIFUグループと比較して、CPDP NPs + LIFUグループは肺結節の最も顕著な減少を示し、これは望ましい肺転移抑制効率を示唆しました。同様の減少傾向は、H＆E染色によってさらに示され（図10c）、これはすべて、この相乗的治療戦略がマウスの肺転移を排除するのに効果的な努力を発揮できることを示しています。

a 肺組織の一般的な外観の画像。 b さまざまな治療間の転移性肺結節の分析（** p <0.01、 n =3）。 c 肺転移性H＆E染色結果の対応する画像（スケールバー：50μm）

ディスカッション

乳がんの転移は、その予後不良に広範囲に影響を与えることが広く認識されています[3、49]。望ましい治療アプローチとして、SDTはその高効率に役立つ可能性があり、深い浸透能力は広く確信されています[11、50]。確かに、超音波増感剤の単一の適用には特定の制限が存在するため、SDTを単独で使用することは、さらなる癌の探索においてはまだ十分ではない可能性があります。臨床医学と組み合わせたナノテクノロジーの開発は、無視できる毒性、非侵襲性、優れた生体適合性などの刺激的なメリットを所有して、近年大幅に促進されています。この新しいアプローチを使用して、研究者は抗腫瘍効率を高めるための多機能治療戦略を探求することに多くの努力を払ってきました。

バイオセーフティはナノエージェントの優先事項です。食品医薬品局（FDA）の認証によって承認された広く受け入れられている資料として、PLGAはアプリケーションで望ましいキャリアとして実行できることが強調されています[51、52]。その利点に基づいて、多機能治療効率を実現するナノシステムを確立し、PLGAを外部構造として利用して、超音波増感剤Ce6、位相シフト材料PFP、および化学療法剤DTXをカプセル化しました。 CPDPナノ粒子（CPDP NP）は、主にコアシェル構造と適切なサイズによって観察されたため、EPR効果による望ましい凝集を実現できました。 CPDP NPの細胞生存率は、24時間の共培養後に80％を超えることが証明されており、このナノプラットフォームの安全性が高いことを示しています。さらに、カプセル化されたPFPの相転移により、LIFUによって活性化されたときに造影剤としてCPDPNPが保証されます。強化された超音波画像診断機能は、理想的な治療ウィンドウを保証するだけでなく、正確な診断と正確な治療の統合を実現するCPDPNPの有望な未来を促進します。

SDTの重要な戦略は、ROSの生成です。 Ce6の単一使用と比較して、PLGAにカプセル化されたCe6は望ましい保護を発揮しました。これは、ROSの結果によって確認できます。私たちの研究では、Ce6の1回の使用で生成されるROSの量はごくわずかでしたが、ナノ粒子でカプセル化されたCe6はかなりの量のROSを生成しました。これは、SDTの効率によってさらに証明されました。結果は、ROSの生成がCPDP NPにカプセル化されたCe6によって維持されたことを示しており、これは後の腫瘍抑制の確固たる基盤を築くことができます。さらに、薬物放出速度はpH 5.5でも示され、ナノ粒子からのCe6の放出はほとんどなく、PLGAによる超音波増感剤の十分な保護を示しています。これはROS生成とSDTの結果によって高効率でさらに証明されました。興味深いことに、pH 5.5でのDTXとCe6の薬物放出効率は、結果に応じてかなり異なり（それぞれ、40％以上と約20％）、2つの薬物の多様なカプセル化効率が原因である可能性があります。 Ce6のわずかな放出速度は、PLGAで効果的に保護できるため、LIFU刺激による実質的なROS生成に到達して、より確実なSDT効率を得ることができることを示しました。この違いのもう1つの理由は、調製プロセス中の2つの薬剤の溶媒が異なるためである可能性があります。具体的には、DTXとPLGAはジクロロメタンに直接溶解しましたが、Ce6は最初にメタノールに溶解し、次にジクロロメタンに滴下する必要がありました。これは、ジクロロメタンへの溶解度が低いためです[53]。ナノ粒子での薬物放出は、その後の併用療法の有効性に直接関係しているため、薬物放出率とROS生成結果の評価は、この点を相互に証明しています。現在の研究では、化学療法を単独で使用しても腫瘍の進行を有意に逆転させることはできない可能性があることが示唆されています[41]。この研究では、私たちが設計したナノプラットフォームは、化学療法の単一の使用と比較して、相乗的治療がinvitroおよびinvivoの両方で治療効率を著しく高めたことを示す強力な証拠を示しました。 LIFU刺激が治療戦略を最適化したため、細胞アポトーシス率の増加が著しく上昇しました。この相乗的戦略により、肺転移は腫瘍細胞レベルと接種マウスモデルの両方で有意に抑制される可能性があることは注目に値します。これは以前の報告と一致しています[16、52]。

結論

結論として、私たちが設計および準備した安全で安定したCPDP NPに加えて、LIFU照射は、乳房腫瘍の進行とその​​肺転移を著しく排除する可能性があります。強化されたイメージング機能を備えたこのナノプラットフォームは、臨床においても有望な造影剤であると考えられていました。したがって、LIFUと組み合わせた新しい相乗的戦略は、転移性乳がんの不良な転帰を逆転させるための効果的な治療アプリケーションと見なされる可能性があります。

略語

LIFU：

低強度集束超音波

SDT：

ソノダイナミックセラピー

PFP：

ペルフレナペント

EPR：

強化された透過性と保持効果

DCFH-DA：

ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート

PI：

ヨウ化プロピジウム

TEM：

透過型電子顕微鏡

ROS：

活性酸素種

Ce6：

クロリンe6

DTX：

ドセタキセル

FBS：

ウシ胎児血清

CCK-8：

細胞計数キット-8

CPDP NP：

Ce6 / PFP / DTX / PLGAナノ粒子

PDP NP：

PFP / DTX / PLGAナノ粒子