迅速臨床免疫アッセイ向け高性能PAMAM-量子ドット複合体

概要

臨床免疫アッセイで使用される複合体群を報告します。この複合体群は、PAMAM共役ヤギ抗ウサギIgGと量子ドット（QDs）共役ヤギ抗マウスIgGで構成されます。ウサギ抗抗原抗体とマウス抗抗原抗体を添加すると、対応する抗原が検出されます。この複合体を用いた実験はシンプル、便利、短時間、少ステップで、フローサイトメトリー（FCM）、免疫細胞化学（ICC）、免疫組織化学（IHC）など様々な実験法に適用可能で、多種多様な抗原検出が可能です。

はじめに

量子ドット（QDs）は、高蛍光量子収率、高光安定性、低光退色性により発光プローブとして広く使用されています。また、細胞イメージングとバイオテクノロジー応用で有機蛍光色素としても広く用いられています。特にカドミウム含有QDs（CdSe、CdTeなど）は、430–660 nm範囲の同一波長照射下で粒径依存的な発光スペクトルを示すという顕著な利点があります。したがって、抗体共役QDsは分子イメージングで最も有望なプローブです。

ポリアミドアミンデンドリマー（PAMAM）は、最も広く深く研究されているデンドリマー高分子の一つで、以下の特徴を持ちます：多数の表面官能基、分子内部の多数の空洞、ナノスケールサイズ、高い生体適合性。薬物や抗体と共役させると、薬物の溶解性と全身循環を改善しつつ、薬物の生物活性を損なわないため、PAMAM修飾抗体は臨床免疫でよく用いられます。

臨床免疫アッセイには、ウェスタンブロット（WB）、ELISA、IHC（免疫組織化学）、ICC（免疫細胞化学）、FCM（フローサイトメトリー）など多くの手法があります。中でもFCMは特異的抗体プローブを用い、単一細胞やその他の生物粒子を細胞・分子レベルで迅速解析できるため、最も広く用いられる免疫アッセイの一つです。細胞スクリーニングを行う場合は対応する抗体プローブのみで十分ですが、小さな生物分子（小さなタンパク質、ウイルス、サイトカインなど）のスクリーニングを望む場合、FCMでは直接検出できないため、CBA（サイトメトリックビーズアレイ）法を採用すべきです。CBA法は、表面に特異的捕獲抗体を構築した染料標識ビーズを利用します。CBAビーズを検体と対応する染料標識抗体と混合すると、ELISAと同様にサンドイッチ複合体が形成され、微小抗原をFCMで検出可能になります。

本研究では、PAMAM共役ヤギ抗ウサギIgGとQDs共役ヤギ抗マウスIgGを含む複合体群を提示します。この複合体群はFCM、ICC、IHCで使用可能です。ウサギ抗抗原抗体とマウス抗抗原抗体を添加すると、対応する抗原が検出されます。このモデルは、対応するマウス抗体とウサギ抗体が存在すれば、小さなタンパク質、ウイルス、サイトカインなど多くの種類の抗原を検出できます。スキーム1にFCMで使用される複合体を示し、HSP27を例として説明します。HSP27はHSPB1（ヒートショックタンパク質ファミリーBメンバー1）としても知られ、薬剤耐性、細胞増殖、アポトーシス、腫瘍発生、転移などに関与する重要なタンパク質です。このモデルでは、PAMAM共役ヤギ抗ウサギIgGがキャリアおよび捕獲役割を果たし、CBAビーズと同様に微小分子抗原をFCMで検出可能にします。QDs共役ヤギ抗マウスIgGは蛍光プローブとして機能します。抗原が膜タンパク質や細胞内タンパク質の場合、従来のFCM法で抗原を検出できます。QDsのみを添加し、PAMAM部分は不要です。細胞内タンパク質と膜タンパク質の場合、細胞自体がFCM法で直接検出可能なターゲットと見なせるため、PAMAM部分で疑似細胞を構成する必要がありません。したがって、複合体を分割して個別に使用することも可能です。

結果と考察

この複合体群はPAMAM部分とQDs部分の2部構成です。PAMAM部分はPAMAM共役ヤギ抗ウサギIgGです。第5世代アミノ末端PAMAMデンドリマー（G5 PAMAM）を表面安定化剤として使用し、水性環境に理想的な溶解性特性を提供しますが、このデンドリマーは強い正電荷を持ち抗体結合に有害です。正電荷を中和するため、PAMAMをDMSOに溶解し、コハク酸無水物（ジヒドロ-2,5-ジケトテトラヒドロフラン）を添加してPAMAMアミノ基を中和しました。PAMAMのアミノ基がコハク酸無水物と反応しアミド結合を形成します。反応後、透析、凍結乾燥、秤量、再溶解を行い、生成物はほぼ中性となり「N-PAMAM」と命名しました。これはヤギ抗ウサギIgGと共役可能です。特にG5 PAMAMは多数の空洞を含み、IgGがG5 PAMAMの空隙に封入される可能性があります。ヤギ抗ウサギIgGをMES緩衝液（0.1 mol/L、pH 6.0）に溶解し、EDCとスルホ-NHS（モル比1:1）を添加、15分インキュベート。最後にN-PAMAM（中性PAMAM）を添加し、4℃シェーカーで一晩インキュベート。このポリマーは水溶液中で自己組立てし、ポリマーミセルを形成して通常不溶性の低分子ゲストを封入します。反応後、未反応物除去のため透析が必要です。その後、凍結乾燥、秤量、保存緩衝液で再溶解し、最終的にN-PAMAM共役ヤギ抗ウサギIgGを得ました。

MES中のN-PAMAM-IgG（ヤギ抗ウサギ）の蛍光スペクトルとUV-Visスペクトルを図1に示します。N-PAMAM（中性PAMAM）とIgGと比較して、N-PAMAM-IgGの蛍光発光ピーク強度が最も低かったです。UV-Visスペクトルでは、IgG、MES緩衝液、PAMAM、N-PAMAMと比較して、N-PAMAM-IgGのみが200 nmに吸収ピークを示しました。蛍光スペクトルでもUV-Visスペクトルでも、N-PAMAM-IgGはN-PAMAMとIgGとは異なる特性を示し、N-PAMAMとIgGが単なる混合ではなく結合していることを間接的に証明しています。N-PAMAM-IgGの抗体活性を検出するためELISAを実施しました。図2に示す通り、IgG（ヤギ抗ウサギ）抗体抵抗性はN-PAMAMとの共役後も失われていません。

QDs部分はQDs共役ヤギ抗マウスIgGです。抗体共役QDsは通常、架橋反応で形成され、抗体分子がQDs表面のカルボキシル基やアミノ基などの官能基と結合します。本研究では、カルボキシル配位子で安定化されたコア/シェルCdSe/ZnS水溶性量子ドットと、EDC（1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩）を用いたカルボジイミド共役反応を採用しました。これは抗体をQDs表面に共役させる最も一般的な方法の一つです。CdSe/ZnS QDsミセルを、EDCとスルホ-NHS存在下でホウ酸緩衝液（5 mM BS、pH 7.2）でインキュベート。次にヤギ抗マウスIgGを添加し、暗所で4℃シェーカー一晩インキュベート。最後に10% BSA（牛血清アルブミン）を添加し未反応QDsをブロッキングし、連続遠心と再溶解で精製して未反応物を除去。QDs共役IgG（ヤギ抗マウス）の抗体活性は、4℃暗所保存で3ヶ月間維持可能です。

保存緩衝液（2.5 mM BS、pH 8.0、0.1% BSA）中のQDs-IgG（ヤギ抗マウス）とQDsの粒径分布を図3aに示します。共役反応後、生成物の直径が明確に増大し、良好な均質性と安定性を示しました。これらは検出プローブとして使用する上で鍵となる特性です。QDs-IgGとQDsの蛍光スペクトルを図3bに示します。図3aで生成物直径増大が示す通りIgGがQDsと結合しましたが、QDs-IgG蛍光発光ピークはQDsと同一でした。この結果は、IgGとQDsの共役がQDsの光学的特性を変化させないことを意味し、免疫アッセイ応用に有用です。QDs-IgGの抗体活性検出のため、PVDFメンブレンを用いたELISA法を実施。マウス抗AKT抗体を1、10、100、200 μg/mLの4濃度勾配に希釈し、同濃度0.1 mg/mLのQDs-IgG（ヤギ抗マウス）とハイブリダイズ。37℃暗所で40分ハイブリダイズ後、PBST（pH 6.0、0.1% Tween 20）で3回洗浄し、UV光照射。蛍光強度を図3cに示し、抗原濃度増加に伴い蛍光強度が増加し、QDs-IgGが高い抗体活性を有することを示しました。

この複合体群をFCMで利用する方法を紹介します。前述の通り、小さなタンパク質、ウイルス、サイトカインなど多くの種類の抗原を検出可能で、HSP27タンパク質を例に詳述します。HSP27は細胞質に存在し、特に肺がん、膵臓がん、尿路上皮がん、腎がん、乳がん、メラノーマなどの腫瘍細胞で大量に分泌されます。HSP27の一部は細胞外分泌されるため、細胞を溶解してタンパク質を抽出する必要があります。本実験では、MCF-7（ヒト乳がん細胞）を試験群、L02（正常ヒト肝細胞）を対照群として選択。細胞を溶解し細胞内タンパク質を抽出。総タンパク質を回収後、タンパク質濃度に応じてウサギ抗HSP27とマウス抗HSP27を添加、37℃で50分インキュベート。次にN-PAMAM-IgGを添加、37℃で30分インキュベート、試験群とPAMAM群の2等分群に分割。最後にQDs-IgGを試験群に添加、37℃暗所で30分インキュベート。図4はフローサイトメトリーによる2群細胞の蛍光解析を示します。MCF-7群では試験曲線の蛍光強度がPAMAM曲線より大幅に高く、L02群では2曲線がほぼ重なりました。検体にHSP27が存在する場合、ウサギ抗HSP27とマウス抗HSP27存在下でN-PAMAM-IgGとQDs-IgGが間接的に結合しサンドイッチ複合体を形成します。HSP27が存在しない場合、非特異的吸着でわずかなQDs-IgGのみがN-PAMAM-IgGに結合します。したがって、試験曲線の蛍光強度が対照PAMAM曲線より高ければ、検体にHSP27が含まれます。図4より、MCF-7細胞がL02細胞より多くのHSP27タンパク質を分泌することがわかります。

前述の通り、これらの複合体はFCMで分泌性細胞内タンパク質を検出可能で、原理的にあらゆる種類の抗原に適用可能です。さらに、複合体の2部分を個別に使用することもできます。検出したい抗原が細胞内または細胞表面に存在する場合、QDs部分のみを使用できます。例えば、β-アクチンは細胞骨格の主要構成要素の一つで細胞内に存在し、真核生物に広く分布します。図5aはHeLa細胞でのβ-アクチン検出にQDs部分のみを用いたFCM蛍光解析を示します。HeLa細胞を洗浄しメタノール処理で細胞膜透過性を高め、2等分。β-アクチン群をマウス抗β-アクチンで37℃30分インキュベート、対照群をBSAでインキュベート。PBS洗浄後、両群をQDs-IgG（ヤギ抗マウス）で37℃30分インキュベート。PBSで2回洗浄後、両群をFCMで検出。β-アクチン曲線の蛍光強度が対照曲線より大幅に高く、HeLa細胞にβ-アクチンタンパク質が含まれることを示しました。

さらに、これらの複合体はICCにも適用可能です。ただしICCでは、標的抗原が細胞内または細胞表面に存在し、大量に存在することが必要です。そうでなければ実験ターゲットをバックグラウンドから区別するのが困難です。β-アクチンタンパク質を例に、HeLa細胞を10 cm培養皿に播種し、カバーグラスを配置、メタノールで細胞固定。細胞をマウス抗β-アクチン（PBS、1% BSA）で37℃1時間インキュベート、PBSTで2回洗浄、QDs-IgG（ヤギ抗マウス）で37℃暗所1時間インキュベート。PBSTで2回洗浄後、DAPIで細胞核染色（2分）、蛍光顕微鏡で検出。図5bはHeLa細胞の蛍光顕微鏡像を示します。QDsを蛍光色素として用いる利点は、QDs信号とDAPI信号を紫外線照射下で同時に観察できるため、細胞核を基準にターゲットを明確に局在化できることです。本実験ではβ-アクチンは細胞核周辺の細胞骨格タンパク質で、明確に観察できました。

結論

結論として、FCMやICCなど臨床免疫アッセイで使用される複合体の応用を実証しました。複合体群はPAMAM共役ヤギ抗ウサギIgGとQDs共役ヤギ抗マウスIgGで構成されます。ウサギ抗抗原抗体とマウス抗抗原抗体を添加すると、対応する抗原が検出されます。これらの複合体は、広いスペクトル、高い生体適合性、高い光安定性、低い生物学的毒性という利点を持ちます。この複合体は、対応する一次抗体を変更するだけで適用可能な汎用モデルです。本論文ではHSP27とβ-アクチン検出に使用しましたが、理論的にはあらゆる種類の抗原に適用可能です。さらに、抗原の特性に応じて検出手法を選択でき、実際のニーズに応じて複合体を分割して個別に使用することも可能です。この方法により、小さなタンパク質やウイルスなどの微小分子もフローサイトメトリーで検出可能になります。適切な改良により、免疫蛍光（IF）、ウェスタンブロット（WB）、ラテラルフローイムノクロマトグラフィーストリップ（LCS）など他の手法にも適用可能になると期待されます。

実験方法

材料

CdSe/ZnS量子ドット（水溶性QDs、カルボキシル基修飾、CAS番号N/A）はNEPQD（中国）製。PAMAM（第5世代アミノ末端、ロット番号CYD-150A）はCYD（中国）製。ヤギ抗ウサギIgG（ab6702）とマウス抗β-アクチン（ab8226）はAbcam（英国）製。マウス抗HSP27（BF0624）とウサギ抗HSP27（AF6082）はAffinity（米国）製。ヤギ抗マウスIgG（bs0296G）はBioss（中国）製。EDCとスルホ-NHSはサーモフィッシャー製。DMEMと胎児牛血清はGibco製。PVDFメンブレン（0.2 μm）はMillipore製。その他すべての化学試薬は分析試薬グレード。

N-PAMAM-IgG（ヤギ抗ウサギ）の調製

1. a) N-PAMAM（中性PAMAM）の調製：PAMAM（G5アミノ末端、平均分子量28826）（60 mg、2.081 mM）をDMSO（2 mL）に溶解し、コハク酸無水物（ジヒドロ-2,5-ジケトテトラヒドロフラン）（0.266 g、2.66 mM）を添加してアミノ基を中和。G5 PAMAM 1モルは128モルのアミノ基を持つため、60 mg PAMAMには0.266 mMアミノ基が含まれ、PAMAMアミノ基とコハク酸無水物のモル比は約1:10。シェーカー（100 rpm）で4時間混合後、3500 MWCO透析膜で24時間透析、凍結乾燥後N-PAMAMを得ました。
2. b) N-PAMAM-IgG（ヤギ抗ウサギ）の調製：MES緩衝液（100 mM、pH 6.0）を調製、100 μLをチューブに取り、20 μM EDCと20 μMスルホ-NHSを添加し低速ボルテックスで撹拌。35.7 μL IgG（pH、0.5 μM）を添加しボルテックス撹拌、さらに19 μg N-PAMAMを添加し4℃で一晩インキュベート。最終的に3500 MWCOと8000 MWCO透析膜で3日間透析、凍結乾燥後N-PAMAM-IgGを得ました。

QDs-IgG（ヤギ抗マウス）の調製

1. a) BS緩衝液の調製：
1. 1. ホウ砂緩衝液（50 mM）調製：ホウ砂19.07 gを1 L超純水に溶解。
2. 2. ホウ酸緩衝液（50 mM）調製：ホウ酸3.09 gを1 L超純水に溶解。
3. 3. 上記2溶液を混合しpH 8.0 BS緩衝液とpH 7.2 BS緩衝液を調製。
4. 4. 洗浄緩衝液（保存緩衝液兼用）：pH 8.0 BS緩衝液を5 mMに希釈し0.1% Tween 20添加。
5. 5. 活性化溶液：pH 7.2 BS緩衝液を5 mMに希釈し0.1% Tween 20添加。
6. 6. EDC緩衝液：EDC 0.27 gを5 mL活性化溶液に溶解。スルホ-NHS緩衝液：スルホ-NHS 0.378 gを5 mL活性化溶液に溶解。
2. b) QDs-IgG（ヤギ抗マウス）の調製：

まず、QDs（CdSe/ZnS、5 mg/mL）450 μLを2.25 mL活性化溶液に溶解、EDC緩衝液150 μLとスルホ-NHS緩衝液150 μLを添加、氷上で5分超音波処理。次に12,000 rpmで5分遠心上澄み除去、沈殿を1.2 mL洗浄緩衝液に溶解、30分超音波混合。100 μg IgG抗体を添加、4℃シェーカーで一晩インキュベート。第3に、10% BSA 150 μL添加、30℃で30分インキュベート、12,000 rpmで2分遠心上澄み除去。沈殿を1 mL洗浄緩衝液に再溶解、12,000 rpmで2分遠心、この工程を繰り返し、最終的に沈殿を1 mL保存緩衝液で溶解。最後に10% BSA添加、完全超音波混合後820 g/minで遠心沈殿除去、上澄みにQDs-IgG含有。QDs-IgGは4℃暗所で3ヶ月保存可能。サンプルは4℃保存のみ可能で、グリセリン入りでも凍結不可。凍結すると大量の量子ドットが凝集・沈殿し、PBSTで洗浄不能となり、深刻なバックグラウンド蛍光を引き起こすことに注意。

HSP27タンパク質のFCM解析

HSP27は細胞質に存在し腫瘍細胞で大量分泌されます。本実験ではMCF-7（ヒト乳がん細胞）を試験群、L02（正常ヒト肝細胞）を対照群として選択。両群を10 cm培養皿に播種、DMEM（10% FBS）で37℃培養。細胞がプレート80%を覆った時点でトリプシン消化、PBSで2回洗浄。1 mL PBSに再懸濁、血球計算盤で細胞数測定、細胞濃度に応じT-PER細胞溶解バッファー添加、細胞溶解液から細胞内タンパク質抽出。細胞溶解液を14,000 rpmで10分遠心上清回収、BCA法でタンパク質濃度測定。タンパク質濃度に応じウサギ抗HSP27とマウス抗HSP27添加、37℃で50分インキュベート。本実験ではL02タンパク質濃度約0.2 mg/mL、MCF-7約0.25 mg/mL、両方500 μL。両抗体を細胞に添加（MCF-7に0.625 μL、L02に0.5 μL）。

1 mg/mL N-PAMAM-IgGを混合液に添加、37℃で30分インキュベート（MCF-7群に6.25 μL、L02群に5 μL添加）。インキュベート後、試験群とPAMAM群の2等分群に分割。最後にQDs-IgGを試験群に添加、37℃暗所で30分インキュベート。両群細胞をフローサイトメトリーで解析。

β-アクチンタンパク質のFCM解析

β-アクチンは細胞骨格主要構成要素の一つで細胞内に存在し、真核生物に広く分布。HeLa細胞を10 cm培養皿に播種、DMEM（10% FBS）で37℃、2日間培養。上清除去、PBSで2回洗浄。トリプシン消化後、800 rpmで3分遠心上清除去、1 mL冷メタノール添加し再懸濁。5分後、800 rpmで3分遠心上清除去、1 mL PBSで再懸濁。この工程を繰り返し、HeLa細胞を2等分。試験群をマウス抗β-アクチンで37℃30分インキュベート、対照群をBSAでインキュベート。本実験ではマウス抗β-アクチンをPBST（1% BSA、5 μg/mL）に溶解、試験群300 μLに100 μL IgG添加、対照群に同量BSA添加。30分インキュベート後、両群をQDs-IgG（ヤギ抗マウス）で37℃30分インキュベート。PBSで2回洗浄後、両群をFCMで評価。

β-アクチンタンパク質のICC解析

HeLa細胞を10 cm培養皿に播種、DMEM（10% FBS）で37℃、1日間培養。滅菌カバーグラス数枚を培養皿に配置、さらに2日間培養。カバーグラス取り出し、PBSで2回洗浄、400 μLメタノールで室温20分インキュベート。カバーグラスをPBSで3回洗浄。ブロッキング緩衝液調製：PBST（0.1% Tween 20）、グリシン22.52 mg/mL、10% BSA。カバーグラスをブロッキング緩衝液に入れ室温30分インキュベート。ブロッキング緩衝液除去、カバーグラスをマウス抗β-アクチン（PBS、1% BSA）で37℃1時間インキュベート、PBSTで2回洗浄、QDs-IgG（ヤギ抗マウス）で37℃暗所1時間インキュベート。PBSTで2回洗浄、DAPIで細胞核染色（2分）、カバーグラスをPBSで1回、水で1回洗浄し蛍光顕微鏡で可視化。