緑色合成カーボン量子ドット/酸化亜鉛ナノコンポジットを用いたCYFRA 21-1の迅速・高感度蛍光免疫測定

概要

肺がんの早期発見において、腫瘍マーカーであるシトケラチン-19断片（CYFRA 21-1）をヒト血清中で迅速に検出することは、患者の生存率向上と迅速な外科的対応に重要な役割を果たします。本研究では、レモン果皮を用いて緑色合成したカーボン量子ドット（CQDs）と酸化亜鉛（ZnO）のナノコンポジットを、CYFRA 21-1抗原の高感度蛍光免疫センシング溶液として用いることを目的としました。提案手法では、水熱法によりレモン果皮からCQDsを調製し、このCQDsを還元・安定化剤として酢酸亜鉛からCQDs-ZnOナノコンポジットを合成しました。サンドイッチ型キャッピング抗体-抗原-抗体免疫センシングシステムを形成するため、非標識モノクローナル抗体BM 19.21をCQDs-ZnOナノコンポジット表面に固定化し、別のモノクローナル抗体KS 19.1をマイクロタイターウェル表面にコートしました。このシステムは、励起波長λ_ex = 470 nm、放出波長λ_em = 520 nmで調整可能な蛍光特性を示します。提案されたナノコンポジット蛍光免疫センシングシステムは、0.01–100 ng mL⁻¹の線形関係と0.008 ng mL⁻¹の検出限界を示しました。CQDs-ZnOナノコンポジットベースの免疫センシングシステムは、ヒト血清中のCYFRA 21-1検出による肺がんの迅速診断への有望なアプローチを提供します。

はじめに

肺がんは最も一般的で侵襲的ながんタイプであり、医療治療において大きな課題となっています。腫瘍の再発と転移は、肺がん患者の死亡の主要な原因と考えられています[1]。腫瘍マーカーであるシトケラチン19断片（CYFRA 21-1）は、多くの正常および悪性上皮細胞に存在する断片です[2]。これはサンドイッチ免疫放射測定法で測定可能です。初期の研究では、肺がんの悪性期においてCYFRA 21-1が患者の血液循環に放出され、血清中で上昇することが明らかにされました[3]。したがって、早期発見とそれに続く迅速な外科的対応により、肺がん患者の生存率を向上させることが可能です[4]。

CYFRA 21-1の検出には、酵素免疫測定法[5]、電気化学発光免疫測定法[6]、免疫放射測定法[7]など、いくつかの手法が報告されています。ヒト血清中のCYFRA 21-1の感度を向上・改善する有利な戦略は、依然として懸案事項です。

近年、ナノテクノロジーはほぼすべてのライフサイエンス分野で大きな進歩と爆発的な成長を遂げています[8]。それらの分野には、薬物送達システム[9]、医薬品分析[10]、触媒活性反応[11]、医療応用[12]、がん腫瘍マーカー[13]、組織イメージング[14]などが含まれます。

現在、蛍光（FL）ベースのセンシング技術は、そのシンプルな設計と優れた感度から多くの研究者を惹きつけています。生物学的モニタリング用に様々なFL感覚材料が設計・合成されています。生物学的決定用FLシステムは、高発光性、水分散性、化学的安定性、無毒性が求められます[15]。バイオマーカー検出用の様々な免疫センシング蛍光プローブがあります。不均一競合アッセイは、捕捉分子を表面に固定化し、蛍光標識バイオマーカーとインキュベートすることで実施されます。遊離バイオマーカーと標識バイオマーカーが捕捉分子への結合を競合するため、バイオマーカー濃度に応じて蛍光強度が低下します[16]。不均一サンドイッチアッセイは、捕捉分子と対象溶液をインキュベートし、バイオマーカーと複合体を形成させます。結果として、蛍光強度はバイオマーカー濃度に応じて増加します[17]。

均一競合アッセイでは、蛍光体A標識捕捉分子と蛍光体B標識バイオマーカー、および溶液を用い、バイオマーカー濃度に応じて蛍光が増加します[18]。しかし、これらの技術には実験時間が長い、多重検出の欠如、複雑さ、時に比較的偽の結果といった欠点がありました。ナノテクノロジーの進歩により、独自の光学特性を持つ新規蛍光免疫センシングプローブの開発が可能となりました[19]。量子ドットが生体分子検出に初めて用いられて以来、その光学的特徴が適切な波長選択の高い柔軟性、多重検出に優れたラベル、生体適合性、標的能力を提供するため、大きな関心を集めています[20]。

カーボン量子ドット（CQDs）は、優れた化学的、物理的、光学的、磁気的、電気的特性を示します。CQDsは水熱法、電気酸化法、レーザーアブレーション法、マイクロ波法など様々な手法で合成可能です[21-24]。低毒性の特徴から、研究者たちはCQDsを多くの蛍光プローブにおける強力な候補と見なしています。また、生化学、光化学、バイオセンシング、バイオイメージング、薬物送達システム[25-27]、免疫測定検出[28]など、様々な要求に応じて制御可能な化学反応で操作する強い能力を持っています。CQDs合成に関する初期研究では、高価な炭素源、有毒化学薬品、非選択的プロセスの使用など、一定の欠点が明らかになりました[29]。これらの欠点を制限するため、研究者たちは果汁を新規かつ安価な炭素源として使用し始めました[30]。果汁の使用は資源利用の最適目標を提供しないため、近年は果皮から蛍光CQDsを得る研究が進んでいます[31]。果皮の利用は、環境に優しいグリーン合成の有望なルートを提供します。

酸化亜鉛（ZnO）は、最も重要で潜在的に活性が高く、安定かつ低毒性の金属酸化物の一つであり、紫外線レーザーデバイス、生物医学分野、各種センサー、光触媒などで広く使用されています[32-35]。ZnOナノ粒子（ZnONPs）は、励起子放出（電子-正孔対の直接再結合に基づく）[36]、または伝導帯端からトラップ準位への電子遷移による緑黄色放出（520 nm）[37]により、近紫外および可視スペクトル領域で光ルミネッセンス特性を示します。

一般的に、カーボンドットは非晶質またはナノ結晶質の準球形ナノ粒子で、sp²およびsp³炭素、O/N基、修飾化学基を含みます。さらに、CQDsはより長い波長で励起でき、電子-正孔対の結合面の効率を変化させ、分析系のクエンチングを処理する能力があり、生体分子の定量的決定を容易にする可能性があります[38]。TiO₂やZnOなどの金属酸化物で修飾し、バイオマーカー検出に利用可能な光学的に活性なナノコンポジットを形成できます。ZnOはワイドバンドギャップ材料（3.37 eV）であり、バンドギャップ内の大きな欠陥準位密度により、紫外および青色可視光領域で発光します[39]。CQDs/ZnOナノコンポジットの形成により、ZnOとCQDsのハイブリダイゼーションにより可視光吸収が増加し、発光吸収の520 nmへのブルーシフトはイオン化酸素空孔の放射的再結合に起因すると考えられます。可視光吸収の増加に加え、より良い電子-正孔分離と界面電子移動時間の短縮が、CQDsとZnOナノ粒子のハイブリダイズによるより高い光学性能の要因と考えられます[40]。さらに、CQDs/ZnOナノコンポジットの水界面で生成する・OH*ラジカルの有意な増加が、分析系の蛍光信号を顕著に上昇させます。したがって、CQDs/ZnOナノコンポジットの結合は、ZnO表面の光電子的・光ルミネッセンス特性の修飾を強化し、調整可能な光ルミネッセンスを持つ強力な表面欠陥を生成します[41]。また、生体認識抗体で固定化されたCQDsが抗体-抗原-抗体FLセンシングシステムを形成し、標的分析物に対する高い特異性と感度を持つ実行可能なプローブを提供します[42]。

本研究では、レモン果皮を炭素前駆体として水熱条件下でCQDsを作製し、さらにCQDsを還元・安定化剤としてCQDs-ZnOナノコンポジットを合成する、新規でシンプルかつ超高感度な免疫測定蛍光センシングシステムを提案します。調製したCQDs/ZnOナノコンポジットを非標識BM 19.21モノクローナル抗体（mAb）で固定化し、マイクロタイターウェルを別のモノクローナルKS 19.1抗体でコートして、サンドイッチキャッピング免疫センシングシステムを形成しました。

材料と方法

機器

CQDsおよびCQDs/ZnOナノコンポジットの分光光度スペクトルは、Ultrospec 2100-Biochrom分光光度計（Biochrom Ltd.、ケンブリッジ、英国）で記録しました。グリーン合成CQDsおよびCQDs/Znナノコンポジットの表面形態と粒子径分布は、透過型電子顕微鏡（TEM）JEOL 1200EX型（JEOL Ltd.、フライジング、ドイツ）と走査型電子顕微鏡（SEM）JSM-7610F型（JEOL、米国）で評価しました。提案免疫センシングシステムの蛍光とフーリエ変換赤外（FT-IR）スペクトルは、Biotek Synergy H1マルチモードリーダー（Biotek、東京、日本）とパーキンエルマーFT-IR分光光度計（パーキンエルマー株式会社、横浜、日本）でそれぞれ確認しました。ラマンスペクトル、X線光電子分光（XPS）、X線粉末回折（XRD）パターンは、マイクロラマン分光計（CRAIC Technologies、カリフォルニア、米国）、クラトスAxis Ultra X線分光システム（クラトス分析株式会社、マンチェスター、英国）、ジーメンスD-5000回折計（ジーメンス、エアフルト、ドイツ）でそれぞれ測定しました。

化学薬品と試薬

全実験で使用した脱イオン水は、SG-2000-10090装置（バルスビュッテル、ドイツ）で調製しました。サンドイッチキャッピング免疫センシングシステム形成用のCYFRA 21-1非標識モノクローナル抗体（mAb）BM 19.21とKS 19.1はアブカム（ケンブリッジ、英国）から入手しました。レモン果実（Citrus lemon）は地元の市場で調達しました。pH 7.4のリン酸緩衝食塩水（PBS）は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、水酸化ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム（BHD Ltd. Co.、プール、英国）で調製しました。ランドックス研究所（北アイルランド、英国）から市販正常血清の提供を受けました。ランダムな血液サンプルは健康なボランティアから採取し、研究開始前にインフォームド・コンセントを取得しました。さらに、シグマアルドリッチ（ハンブルク、ドイツ）から純粋グレードのカルボジイミド塩酸塩（EDC）とN-ヒドロキシサクシニミド（NHS）を供給してもらいました。キングサウド大学研究倫理委員会、KSA（KSU-REC-002-E、2019）が本研究を承認しました。

カーボン量子ドット（CQDs）のグリーン水熱合成

レモン果皮（Citrus lemon）を用いて水熱条件下でCQDsを合成しました。約20 gのレモン果皮と200 mLの脱イオン水を丸底フラスコに移し、連続磁気攪拌下で100°C、6時間還流しました。室温まで冷却後、得られた抽出液を3500 rpmで遠心分離し、上層抽出液20 mLをオートクレーブし、100–200°Cの温度範囲で6–120時間の様々な間隔で水熱処理しました。室温まで冷却後、上澄み液がCQDsを表します（スキーム1）。

カーボン量子ドット-酸化亜鉛ナノコンポジットの調製

CQDs/ZnOナノコンポジットを調製するため、CQDsを還元・安定化剤として用いるシンプルな化学還元反応を行いました。CQDs 20 mLを、60°Cで連続攪拌下、5.0 × 10⁻² mol L⁻¹の酢酸亜鉛50 mLに添加し、10分間反応させました。混合液の色が黄色からクリーム色に変化したら、還元プロセスを完了するため30分間放置し、4°Cで保存しました。調製したCQDs/ZnOナノコンポジットの安定性を確保し凝集を確認するため、UV-Vis分光光度法で390 nmでの吸光度を20日間記録しました。結果、高い安定性とCQDs/ZnOナノコンポジットの吸光度に有意な変化がないことが明らかになりました。

カーボン量子ドット-酸化亜鉛ナノコンポジットのキャラクタリゼーション

CQDs/ZnOナノコンポジットの形成を確認するため、様々な顕微鏡および分光技術を用いました。CQDsおよびCQDs/ZnOナノコンポジットの均一性と表面形態は、高分解能透過型電子顕微鏡（HRTEM）とSEMで調べました。光学スペクトルはUV-Vis、FT-IR、XPS、ラマン分光法で調べました。調製したCQDsの結晶構造はXRDパターンで評価しました。

固定化プロセス

非標識モノクローナルBM 19.21抗体を、合成したCQDs/ZnOナノコンポジット表面に、アミンと活性カルボキシル基の間のシンプルなペプチドアミド結合で固定化しました。固定化プロセスは、等モル濃度3.0 × 10⁻³ mol L⁻¹のNHSとEDC各5.0 mLを、CQDs/ZnOナノコンポジット溶液5.0 mLに連続攪拌下で1時間添加して行いました。非標識モノクローナルBM 19.21抗体約5 mgを、0.01 mol L⁻¹リン酸緩衝食塩水（pH 7.4）1.0 mLに溶解し、上記センシング溶液に添加しました。37°Cで12時間インキュベート後、非標識モノクローナルBM 19.21抗体がCQDs/ZnOナノコンポジット溶液表面に固定化されました（スキーム2）。分光光度法で固定化プロセスの成功を確認しました。

免疫測定法の一般原理

別のモノクローナルKS 19.1抗体でマイクロタイターウェル表面をコートし、サンドイッチキャッピング反応抗体-抗原-抗体を得ました（スキーム3）。最適免疫測定条件下で、CYFRA 21-1抗原濃度を蛍光信号強度の増加関数として決定しました。

免疫センシング手順

ヒト血清検体はランダムなボランティアから提供されました。室温で完全凝固を確認後、遠心分離し4°Cで保存しました。スパイク法を用いて、0.01–500 ng mL⁻¹の濃度範囲でCYFRA 21-1抗原を含む標準サンプルを調製しました。スパイクサンプル約50 μLをマイクロタイターウェルに分注し、リン酸緩衝食塩水（pH 7.4）で新たに希釈したモノクローナルKS 19.1抗体50 μLと混合、30分間反応させ、プレートを覆わず37°Cで1時間インキュベートしました。ウェルの内容物を激しく振って除去し、各ウェルを脱イオン水（300 μL）で3回洗浄しました。固定化CQDs/ZnO-BM 19.21ナノコンポジット溶液約50 μLを各ウェルに添加し、穏やかに混合、37°Cで30分間インキュベートしました。調製サンプルをマイクロタイターリーダーで蛍光分析し、強度を記録しました。

結果と考察

カーボン量子ドットとそのナノコンポジットの形態評価

透過型電子顕微鏡（TEM）を用いて、サンプル中のCQDsの表面形態と分布をキャラクタリゼーションしました。TEM観察のため、調製したCQDs懸濁液約4 μLをTEM用カーボングリッド表面に滴下しました。HRTEM画像（図1a）では、格子間隔（0.36 nm）を持つ均一な黒点が観察され、CQDsの形成を示しました。粒子径分布グラフをプロットし、平均粒子径は1.5 ± 0.5～5.0 ± 0.5 nmの範囲でした（図1b）。得られた粒子径は、形成されたCQDsが確かに量子サイズのナノマテリアルであることを証明しています。さらに、動的光散乱（DLS）を実施し、平均粒子径は~20 ± 0.2 nmと見出されました。前回の2つの測定値には差異が観察されました。先行研究では、CQDsの非晶質な性質により、HRTEMでは高倍率で形成されたCQDsの結晶格子構造が示されないことが明らかにされています[43]。同様に、本研究では天然炭素前駆体がレモン果皮であり、得られたCQDsも非晶質な性質を示しました。したがって、粒子径測定の差異は、形成されたCQDsの凝集、形成されたカーボンドットの非晶質な性質、各実験に関わるメカニズム、粒子の水和動態に起因すると考えられます。

調製したCQDs/ZnOナノコンポジットをTEMとSEMで調査しました。TEM画像（図2a）では、CQDsに付着した六方晶粒子の存在がCQDs/ZnOナノコンポジットの形成を示しました。SEMでは、サンプルを金でコートし、電子吸収と電荷蓄積を防ぎました。印加加速電圧は15 kV、倍率は×30,000でした（図2b）。

CQDsのUV-Visと蛍光スペクトルを調べ、記録されたスペクトルは224 nmと280 nmに2つの有意なピークを示し、それぞれC=CとC=Oのp~p*およびn~P*遷移に起因すると考えられます。また、CQDsの蛍光スペクトルは、最大励起波長λ_ex = 360 nm、放出波長λ_em = 453 nmで2つのシグナルを示しました（図3a, b）。さらに、CQDs/ZnOナノコンポジットのUV-Visスペクトルを調べました。370 nmに有意な吸収ピークが観察され、ブルーグリーンシフトを示しました（図4a）。CQDs/ZnOナノコンポジットの光ルミネッセンス（PL）特性を調べました。CQDsのサイズと表面欠陥は発光特性に大きく影響します。励起波長の関数として、CQDsの（PL）放出は変化しました[38]。また、ZnOナノサイズ粒子は青色から緑色の吸収可視領域で欠陥関連放出を示しました[41]。したがって、CQDs修飾ZnONPsはPL放出に優れたナノコンポジットを生成しました。図4bに示すように、CQDs/ZnOのPLスペクトルは励起波長470 nm後に520 nmに有意なピークを持つブルーシフトを示しました。観察されたシフトは、CQDsとZnONPsのエネルギーバンドの重なりに起因すると考えられます。表示されたブルーシフトは欠陥放出レベル2.1 eVにありました。

CQDs/ZnOナノコンポジットの形成と、非標識モノクローナルBM 19.21抗体で固定化したCQDs/ZnOナノコンポジットを確認するため、比較FT-IR研究を実施しました。CQDsの記録されたFT-IRスペクトルは、特定の官能基に対応する異なる明確なピークを示しました。3462 cm⁻¹と2932 cm⁻¹の伸張振動ピークは、それぞれC-OHとC-H基に対応します。さらに、1749 cm⁻¹、1375 cm⁻¹、1246 cm⁻¹に3つの振動吸収バンドが観察され、それぞれC=O、C-N、C-O-C官能基の存在に対応します（図5a）。Zn-Oの伸張振動バンドに対応する436 cm⁻¹に新しいピークが観察されました。CQDsの還元・安定化特性は、表面の-OHとCOOH基の存在から得られます。これらの官能基は電子供与体として働き、CQDs/ZnOナノコンポジットの形成に強い親和性を持ちます。したがって、CQDsは形成されたナノコンポジットを還元・安定化しました（図5b）。図5cに示すように、3254 cm⁻¹と1675 cm⁻¹に2つの新しいピークが形成されていることが確認されました。これらのピークは、それぞれN-HとC=Oの伸張振動に起因し、ペプチド結合によるCQDs/ZnO-BM 19.21の固定化を確認しました。

グリーン合成CQDsのX線光電子分光（XPS）スペクトルを調べました。得られたCQDsのスペクトル（図6a）は、C=OとCOOHに対応する288 eVと286 eVで異なる官能基を示しました。また、Zn 2p_1/2とZn 2p_3/2に対応する1044.4 eVと1021.5 eVで2つの有意な結合エネルギーピークが観察されました（図6b）。さらに、CQDs/ZnOナノコンポジットの高分解能XPSスペクトルは、O 1s、C 1s、Zn 3s、Zn 3p、Zn 3dに対応する560、385、350、246、200 eVで異なる結合エネルギーピークの存在を確認しました（図6c）。前述のすべてのデータが、CQDs表面へのZnOの存在、すなわちCQDs/ZnOナノコンポジットの形成を証明しました。

CQDsとCQDs/ZnOナノコンポジットのXRDパターンの比較研究を実施しました。CQDsのXRDパターンでは、カーボンドットの20°（2θ）に幅広いピークが観察されました（図7a）。しかし、CQDs/ZnOナノコンポジットでは、Znの（100）、（002）、（101）、（102）、（110）、（103）、（200）、（112）、（201）、（004）、（202）に対応する27°、32°、34°、45°、57°、64°、67°、70°、73°、78°、80°（2θ）で異なる鋭いピークが認識されました。観察されたピークは、CQDs表面へのZnOの分布、すなわちCQDs/ZnOナノコンポジットの形成を反映しています（図7b）。

調製したCQDs、CQDs/ZnO、固定化CQDs/ZnO-BM 19.21ナノコンポジットのラマンスペクトルを調べました。ラマン信号は一般的に結晶構造とその欠陥の研究に用いられます。図8aは、炭素ナノ粒子の典型的なDバンドとGバンドをそれぞれ1300 cm⁻¹と1520 cm⁻¹で示しています。先行報告通り、Dバンドは一般的にsp³欠陥を表し、Gバンドはsp²結合炭素の面内振動の特徴です[44]。調製CQDsのI_D/I_G比を計算し、1.02 ± 0.03と見出されました。ZnOナノ粒子の440 cm⁻¹と520 cm⁻¹に新しい鋭いピークが観察され、CQDsの典型的ピークが1364 cm⁻¹と1595 cm⁻¹で観察されました。I_D/I_G比は1.2 ± 0.01と見出され、CQDs/ZnOナノコンポジットの形成を示しました（図8b）。固定化CQDs/ZnO-BM 19.21ナノコンポジットのラマンスペクトルは、二次構造と三次構造の確認サインとして容易に認識できる多数のピークを示しました。1007–1128 cm⁻¹領域のピークはモノクローナル抗体の主要な二次構造を表すと割り当てられました。550–682 cm⁻¹領域のラマンピークはジスルフィド構造を、867–797 cm⁻¹のものはチロシン残基の水素結合状態を表すと割り当てられました。また、ラマンスペクトルピークの1630 cm⁻¹への有意なシフトは、固定化抗体の三次構造の存在に起因すると考えられます[45]（図8c）。I_D/I_G比は1.4 ± 0.04に増加し、固定化CQDs/ZnO-BM 19.21ナノコンポジットの形成によるより良い結晶構造を示しました。

蛍光免疫センシング条件の最適化

提案した蛍光免疫センシング条件の選択と最適化は、様々なパラメータを研究することで実施しました。一般的に、固定化ナノコンポジット量、使用緩衝液のpHと濃度、血清サンプル中の標的分析物と免疫センシング試薬のインキュベーション時間を調査・最適化すべきです。適切な固定化CQDs/ZnO-BM 19.21ナノコンポジット量を選択するため、10–100 μLの範囲で異なる量をテストしました。固定化CQDs/ZnO-BM 19.21ナノコンポジット50 μL添加時に最大蛍光強度が観察されました（図9a）。pH 7.2–7.5の4種類のリン酸緩衝食塩水溶液を調製し、蛍光強度の関数としてテストしました。pH値の変更による蛍光信号強度のわずかな変化が観察されました。pH 7.2と7.3では、固定化CQDs/ZnOナノコンポジットの化学的不安定性により蛍光信号が減少しました。pH 7.4–7.5では、ナノコンポジット表面のモノクローナル分子間の優れた相互作用により蛍光信号が増加しました（図9b）。pH 7.4が標的抗原の活性を維持するのに最も適したpH値であり、pHを7.5以上に上げると分解される可能性があることがわかりました。したがって、更なる研究ではpH 7.4を選択しました。

リン酸緩衝食塩水濃度の蛍光強度への影響を、0.01–0.05 mol L⁻¹の濃度範囲で推定しました。緩衝液濃度0.01 mol L⁻¹で最大蛍光強度信号が得られました。より高い緩衝液濃度では、固定化CQDs/ZnO-BM 19.21ナノコンポジットが凝集し、免疫センシング溶液の不安定性により蛍光強度が低下する可能性があります（図9c）。免疫反応時間を計算するため、10–60分の反応時間範囲で分析手順を繰り返しました。試験抗原と免疫センシング溶液の反応を少なくとも30分間維持したときに最大蛍光強度信号が観察されました（図9d）。

分析的定量

最適化条件下で、提案免疫測定法を0.01–500 ng mL¹の濃度範囲でCYFRA 21-1抗原を含む12血清サンプルを用いて実施しました。結果をプロットしてキャリブレーショングラフを作成し、0.01–100 ng mL⁻¹の濃度範囲で線形性を示し、検出限界は0.008 ng mL⁻¹でした。算出された式はI_F = 7.933C + 181.24（r² = 0.9992）でした。6回繰り返し後の相対標準偏差（%RSD）は1.3%でした。許容される結果は、血清サンプル中のCYFRA 21-1抗原定量における免疫センシング蛍光法の高感度を示しました。

システム適合性

システム適合性は、提案した固定化CQDs/ZnO-BM 19.21免疫センシング法と先に言及した手法との比較研究により調査しました。提案蛍光システムは、シンプルさ、環境に優しい、血清サンプル中の標的分析物の検出が容易といった顕著な利点を提供しました。記録された結果は、0.01–100 ng mL¹の広い線形検出範囲と0.008 ng mL¹の低い検出限界で高感度を示しました（表1）。

固定化免疫センシングシステムの正確性、精度、選択性

提案した固定化CQDs/ZnO-BM 19.21蛍光免疫センシングシステムによる血清サンプル中のCYFRA 21-1抗原決定の正確性を確保するため、12血清サンプルをテストしました。結果データを、トリス(2,2'-ビピリジル)ルテニウム(II)錯体をトリプロピルアミンで励起する電気化学発光測定法に基づく先行報告手法[6]と比較しました。表2に示す通り、許容される結果が得られました。日内および日間アッセイを用いて提案法の精度を調査しました。テストは、10 ng mL⁻¹のCYFRA 21-1抗原を含む血清サンプルを用いて実施しました。平均相対標準偏差は、日内および日間アッセイでそれぞれ1.1%と1.3%であり、高精度を示しました。さらに、提案法のCYFRA 21-1抗原決定に対する選択性を、アミノ酸（システイン、リシン、セリン、チロシン、グリシン）、一部の陽イオン（K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺）、他のバイオマーカー（CA 15-3、CA 27-29、CA 19-9、CA 125）などの可能性のある干渉物質を用いて評価しました。テストは、10 ng mL⁻¹ CYFRA 21-1抗原を含むヒト血清に10 ng mL⁻¹の共存物質を添加し、最適条件下で実施しました。結果データを相対誤差率（Er%）として計算し、各干渉物質で±5%を超えませんでした（表3）。算出された許容値（F-F⁰/F⁰）は許容限界（<5%）内にありました。したがって、提案した固定化CQDs/ZnO-BM 19.21免疫センシング蛍光システムは、ヒト血清中のCYFRA 21-1抗原決定に対する高い選択性を示しました。

実検体の分析

実ヒト検体において、提案した固定化CQDs/ZnO-BM 19.21溶液ベースの免疫センシング蛍光システムを用いて、腫瘍マーカーCYFRA 21-1抗原の検出と回収率（%）の定量を行いました。前述の免疫センシング手順通り、提案システムを用いて蛍光強度と血清サンプル中のCYFRA 21-1抗原濃度の関係を見出すことで、CYFRA 21-1抗原を決定しました。標的抗原の特定量（0.5、1.0、2.0 ng mL⁻¹）を推定サンプルに添加し、信号強度の増加を評価しました。6回測定後、相対標準偏差率（%RSD）を計算しました。結果の回収率は96.7 ± 0.7～100.0 ± 1.3%の範囲でした。算出された%RSDは0.2–1.4%の範囲でした。テスト血清サンプルを先行報告法[6]で分析したところ、回収率は96.1 ± 1.6～100.0 ± 0.4%、%RSD 0.3–1.7%でした。提案した固定化CQDs/ZnO-BM 19.21溶液を用いた免疫センシング蛍光技術の適合性を確保するため、Studentのt検定とF検定[46]を用いた比較統計学的研究を、現在の結果と先行研究で得られた結果の間で実施しました（表4）。得られたt検定とF検定の値は、それぞれ0.354～2.181（2.228）*および1.16～4.0（5.05）*の範囲で、P = 0.05の表値に関してでした。結果は、提案法と先行発表手順との良好な一致を示しました。また、血清サンプル中で検出されたすべてのCYFRA 21-1抗原量は正常範囲内であり、調査対象血清サンプルでは肺がんは診断されませんでした。

結論

本研究は、前駆体としてレモン（Citrus lemon）を用いたグリーン合成CQDsとZnOナノコンポジットの調製に関するものです。CQDs/ZnOナノコンポジットを用いて、モノクローナルBM 19.21抗体をシンプルなペプチド結合で固定化し、新しい蛍光免疫センシングシステムを形成しました。この高感度蛍光システムを用いて、肺がんの腫瘍マーカー（CYFRA 21-1）をヒト血清中で決定しました。CYFRA 21-1抗原は、マイクロタイターウェルをコートする別のモノクローナル抗体KS 19.1を用いたサンドイッチキャッピング抗体-抗原-抗体反応により決定されました。提案システムの独自の特徴と高感度により、高い安定性と再現性で標的腫瘍マーカーの決定が容易になります。比較研究を実施し、結果が提案免疫センシングシステムの適合性と高感度を確認し、先行報告された従来技術との一致を示しました。

データと材料の入手可能性

本研究からの唯一の成果データは原稿に提示されています。

略語

%RSD:

相対標準偏差パーセント

BM 19–21:

特定モノクローナル抗体

CQDs:

カーボン量子ドット

CQDs/ZnO:

カーボン量子ドット/酸化亜鉛

CYFRA-21-1:

シトケラチン-19断片

DLS:

動的光散乱

EDC:

カルボジイミド塩酸塩

eV:

電子ボルト

FT-IR:

フーリエ変換赤外

HRTEM:

高分解能透過型電子顕微鏡

KS 19-1:

モノクローナルシトケラチン19特異的抗体

Ltd. Co:

有限会社

mAb:

モノクローナル抗体

NHS:

N-ヒドロキシサクシニミド

P:

信頼度

PBS:

リン酸緩衝食塩水

SEM:

走査型電子顕微鏡

TEM:

透過型電子顕微鏡

UK:

英国

USA:

アメリカ合衆国

UV-Vis:

紫外-可視

XPS:

X線光電子分光

XRD:

X線粉末回折

ZnO:

酸化亜鉛

ϴ:

シータ度

λ_max :

波長