新しい免疫センシング-カーボンクォンタムドット/酸化亜鉛ナノコンポジットによる腫瘍マーカーサイトケラチン-19フラグメント（CYFRA 21-1）の蛍光検出

はじめに

肺がんは最も一般的で攻撃的ながんの種類であり、治療において大きな課題があります。腫瘍の再発と転移は、肺がん患者の主な主要な死因と考えられています[1]。腫瘍マーカーサイトケラチン19フラグメント（CYFRA 21-1）は、多くの正常な上皮細胞と悪性の上皮細胞に存在するフラグメントです[2]。サンドイッチ免疫放射分析を使用して推定することができます。初期の研究では、肺がんの悪性段階では、CYFRA 21-1が患者の血液循環に放出され、血清中で上昇することが明らかになりました[3]。したがって、早期発見とその結果としての迅速な外科的反応により、肺がん患者の生存率を改善することが可能です[4]。

CYFRA 21-1の検出については、酵素イムノアッセイ[5]、エレクトロケミルミネッセンスイムノアッセイ[6]、免疫放射分析[7] などの技術はこれまでほとんど報告されていませんでした。 ヒト血清中のCYFRA21-1の感受性を増強および改善するための有利な戦略は、依然として懸念事項です。

近年、ナノテクノロジーの大きな進歩と爆発的な成長が、ほぼすべての生命分野で達成されています[8]。それらの分野の中には、ドラッグデリバリーシステム[9]、製薬分析[10]、触媒活性反応[11]、医療用途[12]、癌腫瘍マーカー[13]、および組織イメージング[14]があります。

今日、蛍光（FL）ベースのセンシング技術は、そのシンプルなデザインと優れた感度により、多くの研究者を魅了しています。生物学的モニタリングのために、さまざまなFL感覚材料が設計および合成されています。生物学的決定のためのFLシステムは、発光性が高く、水分散性があり、化学的に安定しており、毒性がありません[15]。バイオマーカー検出用のさまざまな免疫センシング蛍光ベースのプローブがあります。不均一競合アッセイは、表面に捕捉分子を固定化し、フルオロフォア結合バイオマーカーとインキュベートすることによって実施されます。捕捉分子に結合するための遊離バイオマーカーと結合バイオマーカーの間の競合は、バイオマーカー濃度とともに蛍光強度を低下させます[16]。不均一サンドイッチアッセイは、バイオマーカーと複合体を形成する捕捉分子と目的の溶液のインキュベーションに基づいています。その結果、蛍光強度はバイオマーカー濃度とともに増加します[17]。

同種競合アッセイでは、2つの異なるフルオロフォアA結合キャプチャー分子がフルオロフォアB結合バイオマーカーと結合し、溶液がバイオマーカー濃度とともに蛍光を増加させます[18]。ただし、これらの手法には、実験時間が長い、多重検出の欠如、複雑さ、場合によっては比較的誤った結果など、特定の欠点がありました。ナノテクノロジーの進歩により、研究者は独自の光学特性を備えた新しい蛍光免疫センシングプローブを開発することができました[19]。生体分子検出で量子ドットを最初に使用して以来、それらの光学的特徴は、適切な波長の選択における高い柔軟性、多重検出のための優れたラベル、生体適合性、およびターゲティング能力を提供するため、大きな関心を集めています[20]。

カーボン量子ドット（CQD）は、優れた化学的、物理的、光学的、磁気的、および電気的特性を示しています。 CQDは、熱水法、電気酸化法、レーザーアブレーション法、マイクロ波法など、さまざまな手法を使用して合成できます[21、22、23、24]。毒性が低いため、科学研究者はCQDを多くの蛍光プローブの強力な候補と見なしました。さらに、生化学的、光化学的、バイオセンシング、バイオイメージング、ドラッグデリバリーシステム[25,26,27]や、イムノアッセイ検出[28]など、さまざまな要求において、さまざまな制御可能な化学反応を操作する強力な能力を備えています。 CQDの合成に関する初期の研究では、高価な炭素源、有毒な化学物質や試薬を使用したり、非選択的なプロセスを使用したりすることで、特定の欠点が明らかになりました[29]。これらの不利な点を制限するために、研究者はフルーツジュースを斬新で安価な炭素源として使用し始めました[30]。フルーツジュースの使用は資源を利用するという最適な目標を提供しないため、蛍光CQDは最近フルーツの皮から得られました[31]。果物の皮の使用は、CQDの環境にやさしいグリーン合成のための有望なルートを提供します。

酸化亜鉛（ZnO）は、紫外線レーザーデバイス、生物医学分野、さまざまな種類のセンサー、および光触媒作用で広く使用されている、最も重要で、潜在的に活性で、安定で、毒性の低い金属酸化物の1つです[32、33、34、35]。 ZnOナノ粒子（ZnONP）は、UVおよびVisスペクトル範囲の近くでフォトルミネッセンス特性を示しました。これは、電子正孔対の直接再結合に基づく励起子放出[36]、または伝導帯端からトラップレベルへの電子遷移の結果としての520nmでの緑黄色放出に起因する可能性があります。 [37]。

一般に、カーボンドットは、sp ² を含むアモルファスまたはナノ結晶の準球形ナノ粒子です。 およびsp ³ 炭素、O / Nベースの基、および後修飾化学基。さらに、CQDはより高い波長で励起する能力があり、電子正孔対の結合表面の有効性を変えることができ、分析されたシステムの消光を処理します。これにより、生体分子の定量測定が容易になる場合があります[38]。それらは、TiO ₂ などの金属酸化物で装飾することができます。 およびZnOは、ヒト血清中のバイオマーカーの検出に利用できる光学活性ナノコンポジットを形成します。 ZnOはワイドバンドギャップ（3.37 eV）の材料であり、バンドギャップに高密度の欠陥レベルが存在するため、可視光のUVおよび青色領域で発光する可能性があります[39]。 CQD / ZnOナノコンポジットの形成は、ZnOとCQDのハイブリダイゼーションにより可視光吸収を増加させ、発光吸収の520 nmへのブルーシフトは、イオン化されたO空孔の放射再結合に起因する可能性があります。可視光の吸収の増加に加えて、より良い電子正孔分離と界面電子移動時間の短縮が、ZnOナノ粒子とのハイブリダイズしたCQDのより高い光学性能のために考慮されるかもしれません[40]。さらに、水界面のCQD / ZnOナノコンポジットから生成される–OH *ラジカルの有意義な増加は、分析システムの蛍光シグナルの大幅な上昇を引き起こす可能性があります。したがって、組み合わされたCQD / ZnOナノコンポジットは、ZnO表面のオプトエレクトロニクスおよびフォトルミネッセンス特性の変更を強化し、調整可能なフォトルミネッセンスを備えた強力な表面欠陥を生成します[41]。さらに、抗体-抗原-抗体FLセンシングシステムを形成する生体認識抗体で固定化されたCQDは、標的分析物に対して高い特異性と感度を備えた実行可能なプローブを提供します[42]。

提案された研究は、ヒト血清中の腫瘍CYFRA 21-1マーカーを決定するために、ZnOナノコンポジットで装飾されたCQDに基づく新しいシンプルで超高感度のイムノアッセイ蛍光センシングシステムを提案しました。柑橘類のレモン果皮は、熱水条件を使用してCQDを導出するための炭素前駆体として使用されました。さらに、CQD共役ZnOナノコンポジットの合成のための還元剤および安定剤として使用されました。調製したCQD / ZnOナノコンポジットは、非結合BM 19.21モノクローナル抗体（mAb）によって固定化され、マイクロタイターウェルは別のモノクローナルKS 19.1抗体でコーティングされ、サンドイッチキャッピング免疫センシングシステムを形成しました。

メソッド

楽器

CQDとCQD / ZnOナノコンポジットの両方の分光光度スペクトルを、Ultrospec 2100-Biochrom分光光度計（Biochrom Ltd.、Cambium、Cambridge、UK）を使用して記録しました。グリーン合成CQDおよびCQDS / Znナノコンポジットの表面形態および粒子サイズ分布は、透過型電子顕微鏡（TEM）JEOL 1200EXモデル機器（JEOL Ltd.、Freising、Germany）および走査型電子顕微鏡（SEM）JSM-7610Fモデルを使用して評価しました。 （JEOL、米国）。提案された免疫検知システムの蛍光およびフーリエ変換赤外（FT-IR）スペクトルは、Biotek Synergy H1マルチモードリーダー（Biotek、東京、日本）およびPerkin Elmer FT-IR分光光度計（PerkinElmer Ltd.、横浜、日本）を使用してチェックしました。 、 それぞれ。ラマンスペクトル、X線光電子分光法（XPS）およびX線粉末回折（XRD）パターンは、マイクロラマン分光計（CRAIC Technologies、CA、USA）、Kratos Axis超X線分光システム（Kratos Analytical Ltd. 、マンチェスター、英国）およびシーメンスD-5000回折計（シーメンス、エルフルト、ドイツ）。

化学薬品および試薬

SG-2000-10090機器（ドイツ、バルスビュッテル）を使用して、すべての実験で使用した脱イオン水を取得しました。サンドイッチキャッピング免疫感知システムを形成するためのCYFRA21-1非結合モノクローナル抗体（mAb）BM19.21およびKS19.1は、Abcam（Cambridge、UK）から入手しました。 柑橘系レモン 果物は地元の市場から供給されました。 pH =7.4のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、水酸化ナトリウム、リン酸一カリウム、およびリン酸二ナトリウム（BHD Ltd. Co. Poole、UK）を使用して調製しました。 Randox Laboratories（北アイルランド-英国）は、商業用の通常の血清を親切に提供してくれました。健康なボランティアからランダムな血液サンプルを収集し、この研究を開始する前に、インフォームドコンセントを得ました。さらに、Sigma-Aldrich（ハンブルグ、ドイツ）は、純粋なグレードの塩酸カルボジイミド（EDC）とN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）の両方を提供しました。サウジアラビアのキングサウド大学の研究倫理委員会（KSU-REC-002-E、2019年）が研究を承認しました。

カーボンクォンタムドット（CQD）のグリーン熱水調製

柑橘系レモン 果皮は、熱水条件下でCQDを合成するために使用されました。約20gのシトラスレモン 果皮と200mLの脱イオン水を丸いフラスコに移し、100°Cで6時間連続磁気撹拌しながら還流しました。室温まで冷却した後、得られた抽出物を3500 rpmで遠心分離し、20 mLの上部抽出溶液をオートクレーブにかけ、100〜200°Cの温度範囲で6〜120時間の異なる間隔で熱水条件下で加熱しました。室温まで冷却した後、上液はCQDを表します（スキーム1）。

柑橘類レモンを使用したCQDのグリーン合成 果皮から蛍光CQD溶液および炭素球へ

炭素量子ドットの調製-酸化亜鉛ナノコンポジット

CQD / ZnOナノコンポジットを調製するために、還元剤および安定剤としてCQDを使用して、単純な化学還元反応を実行しました。 CQD / ZnOナノコンポジットは、20mLのCQDを50mLの5.0×10 ^-2 に添加することによって得られました。 mol L ^-1 10分間の連続攪拌下で60°Cで酢酸亜鉛の。混合物の色が黄色がかった色からクリーミーな色に変わったら、混合物を30分間放置して還元プロセスを完了し、4℃で保存しました。安定性を確保し、調製したCQD / ZnOナノコンポジットの凝集を確認するために、UV-Vis分光法を使用して、390nmで20日以内の吸光度を記録しました。結果の結果は、CQD / ZnOナノコンポジットの吸光度に高い安定性と有意な変化がないことを明らかにしました。

炭素量子ドットの特性評価-酸化亜鉛ナノコンポジット

CQD / ZnOナノコンポジットの形成を確実にするために、さまざまな微視的および分光学的手法が使用されました。 CQDおよびCQD / ZnOナノコンポジットの均一性と表面形態は、高分解能透過型電子顕微鏡（HRTEM）とSEMを使用して研究されました。光学スペクトルは、UV-Vis、FT-IR、XPS、およびラマン分光法を使用して研究されました。調製したままのCQDの結晶構造は、XRDパターンを使用して評価しました。

固定化プロセス

非結合モノクローナルBM19.21抗体は、アミンと活性カルボン酸基の間の単純なペプチドアミド結合によって、合成されたCQD / ZnOナノコンポジットの表面に固定化されました。固定化プロセスは、各等モルの3.0×10 ^-3 を5.0mL添加することによって実施されました。 mol L ^-1 NHSおよびEDCを5.0mLのCQD / ZnOナノコンポジット溶液に1時間連続攪拌します。約5mgの非結合モノクローナルBM19.21抗体を1.0mLの0.01mol L ^-1 に溶解しました。 リン酸緩衝生理食塩水（pH =7.4）を上記の検出溶液に加えます。非結合モノクローナルBM19.21抗体は、37°C​​で12時間インキュベートした後、CQD / ZnOナノコンポジット溶液の表面に固定化されました（スキーム2）。分光光度法を使用して、固定化プロセスの成功を確認しました。

CQD / ZnOナノコンポジットの表面へのモノクローナルBM19.21抗体の固定化

イムノアッセイ法の一般原則

マイクロタイターウェルの表面をコーティングする別のモノクローナルKS19.1抗体を使用して、サンドイッチキャッピング反応抗体-抗原-抗体を取得しました（スキーム3）。最適なイムノアッセイ条件下で、CYFRA21-1抗原の濃度を蛍光シグナル強度の増加の関数として決定しました。

図解されたスキームは、サンドイッチキャッピング免疫センシング抗体-抗原-抗体反応を表しています

免疫検知手順

人間の血清の標本コレクションは、ランダムなボランティアによって提供されました。室温で遠心分離する前に完全な凝固を確保し、4℃で保存しました。スパイク技術を使用して、0.01〜500 ng mL ^-1 の濃度範囲のCYFRA21-1抗原を含む標準サンプルを調製しました。 。スパイクしたサンプルの約50μLをマイクロタイターウェルに分注し、pH =7.4のリン酸緩衝生理食塩水を使用して50μLの新たに希釈したモノクローナルKS19.1抗体と30分間混合し、プレートを覆わずに37°Cで1時間インキュベートしました。ウェルの内容物を勢いよく振り出し、各ウェルに脱イオン水（300μL）を使用してウェルを3回すすいだ。約50μLの固定化CQD / ZnO-BM 19.21ナノコンポジット溶液を各ウェルに添加し、穏やかに混合し、37℃で30分間インキュベートしました。調製したサンプルをマイクロタイターリーダーを使用して蛍光分析し、強度を記録しました。

結果と考察

カーボンクォンタムドットとそのナノコンポジットの形態学的評価

透過型電子顕微鏡（TEM）を使用して、サンプルの表面形態とCQDの分布を特徴付けました。 TEMでの検査を行うために、準備したCQD懸濁液の約4μLをTEMのカーボングリッドの表面に滴下しました。 HRTEM画像（図1a）では、格子間隔（0.36 nm）で観察された均一な黒いスポットは、CQDの形成を示していました。粒子サイズ分布グラフがプロットされ、平均粒子サイズは1.5±0.5から5.0±0.5 nmの範囲でした（図1b）。得られた粒子サイズは、形成されたCQDが実際に量子サイズのナノ材料であることを証明した。さらに、動的光散乱（DLS）が実行され、平均粒子サイズは約20±0.2nmであることがわかりました。前の2つの測定値の間に違いが観察されました。以前の研究では、HRTEMは、アモルファスであるため、形成されたCQDの結晶格子構造を高倍率で示さないことが明らかになりました[43]。同様に、この研究では、炭素の天然の前駆体は柑橘類のレモンです。 果皮および派生CQDもアモルファスの性質を示しました。したがって、粒子サイズの測定値の違いは、形成されたCQDの凝集、形成されたカーボンドットのアモルファス性、各実験に関与するメカニズム、および粒子の水和ダイナミクスに起因する可能性があります。

a 直径5nmおよび b のCQDの高分解能透過型電子顕微鏡（HRTEM）画像 TEMに基づくCQDのサイズ分布グラフ

調製したCQD / ZnOナノコンポジットをTEMおよびSEMを使用して調査しました。 TEM画像（図2a）では、CQDに付着した六角形の粒子の存在は、CQD / ZnOナノコンポジットの形成を示しています。 SEMでは、サンプルによる電子吸収と電荷の蓄積を防ぐために、ナノコンポジットサンプルを金でコーティングしました。印加された加速電圧は、倍率×30,000で15 kVでした（図2b）。

a および b CQD / ZnOナノコンポジットの透過型電子顕微鏡および走査型電子顕微鏡画像を表します

CQDのUV-Visおよび蛍光スペクトルが研究され、記録されたスペクトルは、 p に起因する可能性のある224および280nmに2つの有意なピークを示しました。 〜 p * および n 〜 P * それぞれC =CとC =Oの遷移。また、CQDの蛍光スペクトルは、最大λ _ex で2つのシグナルを示しました。 =360およびλ _em =453 nm（図3a、b）。さらに、CQD / ZnOナノコンポジットのUV-Visスペクトルを調べました。 370 nmに有意な吸収ピークが観察され、青緑色のシフトが見られました（図4a）。 CQD / ZnOナノコンポジットのフォトルミネッセンス（PL）特性を研究しました。 CQDのサイズと表面欠陥は、CQDの発光特性に大きく影響します。励起波長の関数として、CQDの（PL）発光が変化しました[38]。また、ZnOナノサイズの粒子は、青から緑の吸収可視領域で欠陥に関連した発光を示しました[41]。したがって、CQDで装飾されたZnONPは、PL発光用の優れたナノコンポジットを生成しました。図4bに示すように、CQD / ZnOのPLスペクトルは、励起波長470nmの後に520nmに有意なピークを持つ青方偏移を示しました。観察されたシフトは、CQDとZnONPのエネルギーバンド間のオーバーラップに起因する可能性があります。表示された青方偏移は、欠陥放出レベル2.1eVでした。

CQDの分光スペクトル（ a ）224および280 nmでのUV-Visスペクトルおよび（ b ）λ _ex でのCQDの蛍光スペクトル =360およびλ _em =452 nm

CQD / ZnONPの分光スペクトル a 370nmおよび b の吸収ピークでのUV-Visスペクトル λ _ex でのCQD / ZnONPのフォトルミネッセンススペクトル =470およびλ _em =520 nm

非結合モノクローナルBM19.21抗体を用いたCQD / ZnOナノコンポジットおよび固定化CQD / ZnOナノコンポジットの形成を確認するために、FT-IRの比較研究を実施しました。記録されたCQDのFT-IRスペクトルは、3462 cm ^-1 での伸縮性振動ピークを含む、特定の官能基に対応するさまざまな異なるピークの存在を明らかにしました。 および2932cm ^-1 それぞれC–OHおよびC–Hグループの場合。さらに、1749 cm ^-1 に3つの振動吸収帯が観測されました。 、1375 cm ^-1 、および1246 cm ^-1 それぞれC =O、C–N、およびC–O–C官能基の存在に対応します（図5a）。 436 cm ^-1 の新しいピーク Zn–Oの伸縮振動帯に対応するものが観察されました。 CQDの還元および安定化特性は、それらの表面に–OHおよびCOOH基が存在することから得られました。これらの官能基は電子供与体として機能し、CQD / ZnOナノコンポジットの形成に対して強い親和性を持っています。したがって、CQDは、形成されたナノコンポジットを還元および安定化しました（図5b）。図5cに示すように、3254 cm ^-1 に2つの新しいピークが形成されていることがわかりました。 および1675cm ^-1 。これらのピークは、それぞれN–HとC =Oの伸縮振動に起因し、ペプチド結合を介したCQD / ZnO-BM19.21の固定化を確認しました。

a のFT-IRスペクトル CQD、 b CQD / ZnOナノコンポジット、および c 固定化されたCQD / ZnO-BM19.21ナノコンポジット

緑で合成されたCQDのX線光電子分光法（XPS）スペクトルを調べた。得られたCQDのスペクトル（図6a）は、C =OとCOOHでそれぞれ288と286eVで異なる官能基を示しました。また、Zn 2p _1/2 の場合、1044.4および1021.5eVに2つの有意な結合エネルギーピークが観察されました。 およびZn2p _3/2 、それぞれ（図6b）。さらに、CQD / ZnOナノコンポジットの高分解能XPSスペクトルにより、O 1s、C 1s、Zn 3s、Zn 3p、およびZn 3dの560、385、350、246、および200eVに異なる結合エネルギーピークが存在することが確認されました。それぞれ（図6c）。前述のすべてのデータは、CQD / ZnOナノコンポジットを形成するCQDの表面にZnOが存在することを証明しました。

a のX線光電子分光法（XPS）スペクトル CQD、 b ZnO、および c CQD / ZnOナノコンポジット

CQDとCQD / ZnOナノコンポジットのXRDパターン間の比較研究を実施しました。 CQDのXRDパターンでは、カーボンドットの20°（2Ɵ）に広いピークが見られました（図7a）。ただし、Zn（100）の場合、27°、32°、34°、45°、57°、64°、67°、70°、73°、78°、および80°（2°）で異なる鋭いピークが認識されました。それぞれ（002）、（101）、（102）、（110）、（103）、（200）、（112）、（201）、（004）、および（202）。観察されたピークは、CQD / ZnOナノコンポジットを形成するCQDの表面でのZnOの分布を反映しています（図7b）。

a のX線回折パターン CQDと b CQD / ZnOナノコンポジット

調製されたCQD、CQD / ZnO、および固定化されたCQD / ZnO-BM19.21ナノコンポジットのラマンスペクトルを研究しました。ラマン信号は、結晶構造とその欠陥を研究するために一般的に使用されます。図8aは、1300および1520 cm ^-1 での2つの典型的なDおよびGバンドを示しています。 それぞれカーボンナノ粒子用。以前に報告されたように、Dバンドは一般的にsp ³ を表します 欠陥、およびGバンドはsp ² の平面振動の特徴です -結合炭素[44]。 私 _D / 私 _G 調製したCQDの比率を計算したところ、1.02±0.03であることがわかりました。 440および520cm ^-1 に新しい鋭いピークが観察されました。 ZnOナノ粒子の場合、CQDの典型的なピークは1364および1595 cm ^-1 で観察されました。 。 I の比率 _D / 私 _G 1.2±0.01であることがわかり、CQD / ZnOナノコンポジットの形成を示しています（図8b）。固定化されたCQD / ZnO-BM 19.21ナノコンポジットのラマンスペクトルは、二次および三次構造の確認の兆候として容易に認識できる多数のピークを示しました。 1007–1128 cm ^-1 の領域で観測されたピーク モノクローナル抗体の主要な二次構造を表すために割り当てられました。ラマンピークは550–682 cm ^-1 領域はジスルフィドコンフォメーションを表すために割り当てられ、867–797 cm ^-1 1つは、チロシン残基の水素結合状態を表すために割り当てられました。また、ラマンスペクトルのピークが1630 cm ^-1 に大幅にシフトしています。 固定化された抗体の三次構造の存在に起因する可能性があります[45]（図8c）。 I の比率 _D / 私 _G は1.4±0.04に増加し、固定化されたCQD / ZnO-BM19.21ナノコンポジットの形成により結晶構造が改善されたことを示しています。

a のラマンスペクトルシフト CQD、 b CQD / ZnOナノコンポジット、および c 固定化されたCQD / ZnO-BM19.21ナノコンポジット

蛍光免疫センシング条件の最適化

提案された蛍光免疫センシング条件の選択と最適化は、さまざまなパラメーターを研究することによって実施されました。一般に、固定化されたナノコンポジットの量、使用されるバッファーのpHと濃度、血清サンプル中の標的分析物間のインキュベーション時間、および免疫検出試薬を調査し、最適化する必要があります。固定化されたCQD / ZnO-BM 19.21ナノコンポジットの適切な量を選択するために、10〜100μLの範囲のさまざまな量がテストされました。最大蛍光強度は、50μLの固定化CQD / ZnO-BM 19.21ナノコンポジットを添加することで観察されました（図9a）。 pH 7.2〜7.5の値の4つのリン酸緩衝生理食塩水を調製し、蛍光強度の関数としてテストしました。 pH値を変えることにより、蛍光シグナル強度のわずかな変化が観察されました。 pH 7.2および7.3では、固定化されたCQD / ZnOナノコンポジットの化学的不安定性のために蛍光シグナルが減少しました。ナノコンポジットの表面にあるモノクローナル分子間の優れた相互作用により、蛍光シグナルはpH 7.4から7.5に増加しました（図9b）。 ７．４は、ｐＨを７．５より高くすることによって分解され得る標的抗原の活性を維持するための最も適切なｐＨ値であることが見出された。したがって、さらなる研究のためにpH7.4が選択されました。

λ _ex でのCYFRA21-1抗原の蛍光測定の最適化 =470およびλ _em =520nm。 a 追加された固定化CQD / ZnO-BM 19.21ナノコンポジット、 b の効果 pH範囲7.3〜7.5のリン酸緩衝生理食塩水の効果、 c 0.01–0.05 mol L ^-1 の濃度範囲でPBSを使用したバッファー濃度の影響 、および d 10〜60分を使用した免疫反応時間の影響

リン酸緩衝生理食塩水濃度が蛍光強度に及ぼす影響は、0.01〜0.05 mol L ^-1 の濃度範囲を使用して推定されました。 。最大蛍光強度シグナルは、0.01 mol L ^-1 のバッファー濃度を使用して得られました。 。より高いバッファー濃度では、固定化されたCQD / ZnO-BM 19.21ナノコンポジットが凝集し、免疫検出溶液が不安定になると、蛍光強度が低下する可能性があります（図9c）。免疫反応時間を計算するために、10〜60分の範囲の反応時間を使用して分析手順を繰り返しました。最大の蛍光強度シグナルは、テストした抗原と免疫検出溶液の間の反応を少なくとも30分間維持することによって観察されました（図9d）。

分析的定量化

最適化された条件下で、推奨されるイムノアッセイ法は、0.01〜500 ng mL ¹ の濃度範囲のCYFRA21-1抗原を含む12の血清サンプルを使用して実行されました。 。結果の結果をプロットして、0.01〜100 ng mL ^-1 の濃度範囲で線形のキャリブレーショングラフを作成しました。 検出限界は0.008ng mL ^-1 。計算された方程式は I であることがわかりました _F =7.933C + 181.24（ r ² =0.9992）。 6回繰り返した後、相対標準偏差（％RSD）のパーセンテージは1.3％でした。許容できる結果は、血清サンプル中のCYFRA21-1抗原の定量化のための免疫センシング蛍光法の高感度を明らかにしました。

システムの適合性

システムの適合性は、提案された固定化CQD / ZnO-BM19.21免疫検知法と以前に対処された方法との比較研究を実施することによって調査されました。提案された蛍光システムは、単純さ、環境にやさしい、血清サンプル中の標的分析物の検出が容易などの重要な利点を提供しました。記録された結果は、0.01〜100 ng mL ¹ の広い線形検出範囲で高感度を示しました。 検出下限0.008ng mL ¹ （表1）。

固定化免疫センシングシステムの精度、精度、選択性

血清サンプル中のCYFRA21-1抗原を測定するために、提案された固定化CQD / ZnO-BM 19.21蛍光免疫センシングシステムの精度を確保するために、12の血清サンプルをテストしました。結果データは、トリプロピルアミンによって励起されるトリス2,2'-ビピリジルルテニウム（II）錯体を使用したエレクトロケミルミネッセンスアッセイに基づいた、以前に報告された別の手法[6]と比較されました。表2に示すように、許容できる結果が得られました。日中および日中のアッセイを使用して、提案された方法の精度を調査しました。テストは、10 ng mL ^{− 1} を含む血清サンプルを使用して実施されました。 CYFRA21-1抗原の。平均相対標準偏差は、日中および日中の両方のアッセイでそれぞれ1.1％および1.3％であり、高精度であることが明らかになりました。さらに、CYFRA 21-1抗原の決定に向けた提案された方法の選択性は、アミノ酸（システイン、リジン、セリン、チロシン、およびグリシン）、いくつかの陽イオン（K ⁺ 、Na ⁺ 、Ca ²⁺ 、Mg ²⁺ 、およびZn ²⁺ ）およびCA 15-3、CA 27-29、CA 19-9、CA125などの他のバイオマーカー。テストは、10 ng mL ^{-1 10 ng mL -1 の存在下でのCYFRA21-1抗原 共存する種。結果データは相対パーセント誤差（Er％）として計算され、対応する結果は各干渉種で±5％を超えませんでした（表3）。計算された許容値（F-F 0 / F 0 ）は許容限界（<5％）であることがわかりました。したがって、提案された固定化CQD / ZnO-BM 19.21免疫センシング蛍光システムは、ヒト血清中のCYFRA21-1抗原の測定に対して高い選択性を示しました。}

実際の標本の分析

実際のヒト検体では、固定化されたCQD / ZnO-BM 19.21溶液に基づく提案された免疫感知蛍光システムは、腫瘍マーカーCYFRA 21-1抗原の回収率（％）を検出および定量化するために利用されていました。免疫検知手順で前述したように、提案されたシステムを使用して、血清サンプル中のCYFRA21-1抗原の蛍光強度と濃度の関係を見つけることによってCYFRA21-1抗原を決定しました。特定の量の標的抗原（0.5、1.0、および2.0 ng mL ^-1 ）を推定サンプルに追加し、信号強度の増加を評価しました。 6回の測定後、相対標準偏差のパーセンテージ（％RSD）が計算されました。結果の回収率は、96.7±0.7から100.0±1.3％の範囲であることがわかりました。計算された％RSDは0.2〜1.4％の範囲でした。テストされた血清サンプルは、以前に報告された方法[6]を使用して分析され、回収率は96.1±1.6から100.0±0.4％の範囲で、％RSD 0.3–1.7％であることがわかりました。固定化されたCQD / ZnO-BM 19.21溶液を使用して、提案された免疫センシング蛍光技術の適合性を確保するために、Studentの t を使用した比較統計研究 テストと F テスト[46]は、現在の結果と以前に実施された方法から他の人が得た結果との間で実施されました（表4）。得られた t テストと F テスト値は、 P の表の値に対して、0.354〜2.181（2.228）*および1.16〜4.0（5.05）*の範囲であることがわかりました。 それぞれ=0.05。結果は、提案された方法と以前に公開された手順との間の良好な一致を明らかにしました。また、血清サンプルで検出されたCYFRA 21-1抗原の量はすべて正常範囲内であり、調査した血清サンプルで肺がんが診断されなかったことを示しています。

結論

本研究は、柑橘類レモンを使用したZnOナノコンポジットと結合したグリーン合成CQDの調製に関するものでした。 前駆体として。 CQDs / ZnOナノコンポジットを使用して、単純なペプチド結合を介してモノクローナルBM 19.21抗体を固定化することにより、新しい蛍光免疫センシングシステムを形成しました。高感度蛍光システムを使用して、ヒト血清中の肺がんの腫瘍マーカー（CYFRA 21-1）を決定しました。 CYFRA 21-1抗原は、マイクロタイターウェルをコーティングする別のモノクローナル抗体KS19.1を使用したサンドイッチキャッピング抗体-抗原-抗体反応によって決定されました。提案されたシステムの独自の機能と高感度により、高い安定性と再現性を備えた標的腫瘍マーカーの決定が容易になります。比較研究が実施され、結果の結果は、提案された免疫検知システムの適合性と高感度を確認し、結果は以前に報告された従来の技術と一致していました。

データと資料の可用性

この研究からの唯一の結果データは原稿に提示されました。

略語

％RSD：

相対標準偏差のパーセンテージ

BM 19–21：

特定のモノクローナル抗体

CQD：

カーボン量子ドット

CQDs / ZnO：

炭素量子ドット/酸化亜鉛

CYFRA-21-1：

Cytikeratin-19フラグメント

DLS：

動的光散乱

EDC：

カルボジイミド塩酸塩

eV：

電子ボルト

FT-IR：

フーリエ変換赤外

HRTEM：

高分解能透過型電子顕微鏡

KS 19-1：

モノクローナルサイトケラチン19特異的抗体

Ltd。 Co：

有限会社

mAb：

モノクローナル抗体

NHS：

N-ヒドロキシスクシンイミド

P：

自信度

PBS：

リン酸緩衝生理食塩水

SEM：

走査型電子顕微鏡

TEM：

透過型電子顕微鏡

英国：

団結王国

米国：

アメリカ合衆国

UV-Vis：

紫外可視

XPS：

X線光電子分光法

XRD：

X線粉末回折

ZnO：

酸化亜鉛

ϴ：

シータ度

λ _max ：

波長