気道上皮細胞に関するペロブスカイトナノ粒子の毒性研究

要約

ナノ粒子の毒性に関する研究は、一般的な日常の材料での普及が進んでいるため、近年発展してきました。さまざまなナノ粒子が粘液分泌を促進および誘発することが報告されており、これは気道の損傷や呼吸器の合併症を引き起こす可能性があります。 Lanthanum strontium manganite（LSM）は、O ₂の高い電気伝導率、高い電気化学的活性により、太陽酸化型燃料電池（SOFC）で広く使用されているナノ粒子です。還元反応、SOFC電解質の高い熱安定性と適合性、そして最も重要なのは、その微細構造の安定性と長期性能です。 LMSの毒性についてはほとんど研究が行われていないため、この研究では気道細胞への影響を調査しました。 500μg/ mlまでのLSMの濃度を上げて気管細胞を処理した後、気管が細胞生存率、ROS産生、シトクロムC、およびカスパーゼ3発現に中程度の影響を与えることがわかりました。記載されているアポトーシス誘導特性への影響は最小限であるにもかかわらず、LSMは粘液分泌に対する阻害効果を示しました。 LSM治療の濃度を上げると粘液分泌が減少する傾向が見られました。全体として、SOFCにおけるLSMの進歩には毒性研究が必要であり、気管細胞に対する重大な毒性は示されていませんが、LSMは粘液分泌を減少させ、気道クリアランスを妨げる可能性があります。

はじめに

Lanthanum strontium manganite（LSM）は、ペロブスカイトベースの結晶構造を備えたナノ粒子です。これは「ABO3」の一般的な形式を取り、ランタンとストロンチウムがAサイトにあり、マンガンがBサイトにあります。これにより、La _{1 − x}の一般式が得られます。 Sr _x MnO ₃ ここで、xは、ナノ粒子の適用に依存するストロンチウムドーピングレベルを表します。 LSMは、粉末状でテープキャスティング、空気/熱/プラズマスプレーとして、および燃料電池アプリケーションに使用できます[1,2,3,4]。

汚染を減らし、水素ベースの経済を生み出すための最近の取り組みでは、多くの研究が固体酸化物燃料電池（SOFC）に焦点を合わせています[5、6]。次に、LSMペロブスカイトは、その最も重要な電極材料の1つとしてSOFCで重要な役割を果たしているため、研究の注目を集めています[4、7]。 LSMナノ粒子は、茶色または黒色の結晶性粉末として現れる球状の高表面金属粒子です。 LSMの機械的および電気的特性に関する多くの研究が行われていますが[1、3、8、9]、その生物学的効果に焦点を当てた研究はほとんどありません[10、11、12]。多数のナノ粒子が粘液の分泌と蓄積を促進する傾向を示しており、したがって呼吸器疾患に関連しています[13、14]。 LSMナノ粒子に関する研究は、生物医学的応用のための有望なアイデアを示しています[15、16、17]。最近、LSMに関する研究により、抗がん療法の可能性が示されました[12、18、19]。正しい合成手順と表面修飾により、LSMはMRI造影剤、温熱療法剤、および薬物担体になることができます[20、21、22]。ただし、毒性の可能性は、さらなる医療用途の前に評価する必要があります。ペロブスカイトの毒性効果に関する研究は限られており[10、23]、これまでに報告されている重大な毒性効果はありません。

この研究では、毒性濃度範囲を決定するために、初代気管上皮細胞に曝露しながら、LSMナノ粒子の毒性を調査しました。次に、活性酸素種（ROS）の生成とミトコンドリアの損傷を、蛍光顕微鏡を使用して粘液分泌反応とともに分析しました[24]。 LSMナノ粒子がある場合とない場合のアポトーシス進行のレベルは、シトクロムCおよびカスパーゼ3アッセイで調べられました[25]。

結果と考察

NPの特性評価と細胞生存率アッセイ

ナノ粒子の毒性は、形状、サイズ分布、表面積などの物理的特性に依存します。毒性実験の前に、これらの特性はSEMを使用して分析されました。 LSMナノ粒子は、かなりの表面粗さを示し、直径が約35nmから200nmのさまざまなサイズの凝集体に分布していました（図1）。

以前の研究[26、27]で、さまざまなNPを使用して気管気道細胞に対して多数の毒性実験を実施したため、この細胞株がこの生物学的研究に選択されました。気管細胞に対するLSMの全体的な毒性を評価するために、比色CCK8細胞生存率アッセイを実施しました[25、27]。図2に示すように、細胞生存率アッセイでは、LSMの濃度が50から100μg/ mlになると人口に劇的な変化が見られました。ただし、100μg/ mlを超えるLSM濃度では、個体数は比較的安定した範囲に維持され、有意な変化は見られませんでした。

ROSの生成とムチンの放出

ROSの生成はアポトーシスを引き起こし、ナノ粒子の細胞毒性に寄与します。図3によると; ROSの生成、LSMの濃度を上げても、ROSの生成に大きな影響はありません。 250μg/ mlのLSM濃度は対照と最も異なっていましたが、その偏差は有意ではなく、LSMがROS産生に顕著な影響を与えていないことを示しています。

図4から。粘液バタ、15分の処理後、細胞生存率に有意な影響はなく、LSM濃度が増加するにつれて、ムチン分泌は減少しました。細胞を500μg/ mlのLSMで処理すると、ムチンの放出は40％まで減少し、さらに高濃度のLSMを使用するとさらに減少する可能性があります。この減少は、LSMが粘液放出を抑制する効果があることを示唆しています。

ミトコンドリアの損傷とアポトーシスのプロセス

アポトーシスの初期段階は、通常、ミトコンドリアの損傷によって表されます。この現象を分析するために、JC-1色素をミトコンドリア膜電位インジケーターとして使用しました。 JC-1色素によって誘発される強度比は、ミトコンドリアの完全性の喪失と相関関係があり、図5によると、LSM濃度が増加すると、100μg/ mlのLSM処理後にミトコンドリアの損傷が大幅に増加しました。結果は、100μg/ mlのLSM処理後にミトコンドリアの損傷が顕著であることを示していますが、以下に詳述するように、カスパーゼ3とシトクロムCはわずかに減少しています。この結果は、LSMがミトコンドリアの損傷を引き起こす可能性があることを示唆していますが、細胞はアポトーシスの進行を低レベルに保ち、アポトーシスマーカーの発現を低下させる能力を持っています。

アポトーシスは、シトクロムCとカスパーゼ3の発現によっても測定できます。図6aに示すように。シトクロムCのアポトーシスの結果、LSMと対照群の異なる濃度の間でアポトーシス率の適度な減少がありました。これと同じ傾向が図6bにも見られます。アポトーシスはカスパーゼ3に生じ、LSMによる毒性が非常に少ないことを示しています。全体として、LSMによる気道気管細胞のミトコンドリア損傷とアポトーシスの結果は非常に低く、LSMが気管上皮細胞に重大な毒性作用を及ぼさないことを示唆しています。

結論

最近のナノ毒性研究は、工業製品および商業製品で広く使用されているため、NPの毒性効果について多くの注目を集めています。ナノ毒性の主な懸念は、ROSの生成によるものです。たとえば、TiO ₂ NPは、細胞死や突然変異を引き起こす可能性のある大量のROSが生成されるため、一種の発がん性物質と見なされています[28]。ペロブスカイトとして分類される材料と化合物にはさまざまな種類があり、近年、さまざまな用途で報告されています。これは、細胞がNPを取り込むための主要な経路の1つである気道上皮細胞に対するLSM毒性を決定する最初の研究です。この研究は、気管細胞の毒性を評価するために、気管細胞に対するLSMの影響を調査することを目的としています。結果は、LSMが、シトクロムCおよびカスパーゼ3の発現によって測定されるアポトーシスの進行、JC-1蛍光によって測定されるミトコンドリアの完全性、細胞の生存、およびROSの生成に有意な影響を及ぼさないことを示しました。しかしながら、治療は粘液分泌に対する抑制効果を示し、LSM濃度が増加するにつれて粘液産生を減少させた。最終的に、この研究から得られた結果を通じて、LSMは気道上皮細胞に対して無毒であり、アポトーシス段階に有意な変化を引き起こさず、さらに細胞の生存を危険にさらす可能性のある粘液分泌を低下させることがわかりました。これは、LSMが気道粘液クリアランスを妨げる可能性があることを示唆しています。私たちの研究では、LSM NPの毒性の可能性を実証し、その結果は、毒性効果の潜在的なリスクが、産業および商業用途に使用された他のNPよりも比較的低いことを示しています。ただし、LSMを商用の太陽光およびエネルギー貯蔵製品の有効成分として安全に組み込むことができるかどうかを判断するには、さらに調査を行う必要があります。

材料と方法

気管一次電池の培養

気管初代上皮細胞は、以前に公開されたプロトコル[26]に従って、正常なウシ気管支上皮から分離されました。細胞は、事前に認定されたヒト組換え上皮成長因子1–53（EGF 1–53）およびウシ下垂体抽出物（BPE）（Thermo Fisher）を添加した無血清培地（SFM）で増殖および維持されました。初代気管細胞は、コラーゲン（）でプレコートされた15 cm Falconプレートで培養され、37°C、5％CO ₂の加湿インキュベーターで培養されました。。細胞数は、トリパンブルー（Sigma）排除とBright-Line血球計算盤を使用して実行されました。コンフルエンスが80％に達したときに細胞を通過させました。

セルの準備

細胞を5×10 ⁴ で播種しました細胞生存率アッセイ用のコラーゲンコーティングされた96ウェルプレート（75％コンフルエンス）のウェルあたりの細胞数、5×10 ⁵ Ca ²⁺ 用のコラーゲンコーティングされた4ウェルプレート（75％コンフルエンス）のウェルあたりの細胞数シグナル伝達、ROSおよびミトコンドリア分析。播種後、細胞を、事前に認定されたヒト組換えEGF 1–53およびBPE（Thermo Fisher）を添加したSFMで24時間インキュベートしました。 24時間のインキュベーション後、培地を細胞から除去し、培養物をリン酸緩衝生理食塩水で2回リンスしました。 PBS洗浄は、Ca ²⁺ で超音波処理されたナノ粒子に置き換えられました。ハンクスまたはCa ^{2 +} を含む -無料のハンク。

細胞生存率アッセイ

細胞毒性の光比色定量は、CCK-8色素（Dojindo Laboratories、東京、日本）を使用して評価されました[27、25]。非放射性であるCCK-8は、さまざまなNP濃度にさらされた生細胞のパーセンテージの比色測定を提供します。このアッセイキットは、生細胞内のデヒドロゲナーゼの代謝活性を測定して、WST-8テトラゾリウム塩を水溶性ホルマザンに変換します。これは、HBSS中のCCK-8を1:10希釈で添加することによって調製されました。細胞をHBSSでリンスし、100μLの色素を各ウェルにロードしました。次に、細胞を37°C、5％CO ₂でインキュベートしました。 6時間のインキュベーター。吸光度は、Thermo Multiscan EXプレートリーダー（Thermo Multiskan EXプレートリーダー、VWR、CA、USA）を使用して、450 nm（650 nmリファレンス）の光学密度で測定しました。平均は、未処理のコントロールを含む各濃度の3つの個別のデータセットから、3つの独立した実験から計算され、未処理のコントロールのパーセンテージとして表にされました。

細胞生存率は\（\ frac {OD_ {450 \ mathrm {treatment}}-{OD} _ {650 \ mathrm {treatment}}} {O {D} _ {450 \ mathrm {control}}-Oによって計算されました{D} _ {650 \ mathrm {control}}} \ ast 100 \％\）。

Lanthanum StrontiumManganiteナノ粒子

Lanthanum strontium manganite（La _0.15 Sr _0.85 MnO ₃ ）（LSM）ナノ粒子（35 nm、99.5％）（Nanostructured＆Amorphous Materials Inc.）をこの研究で使用しました。すべてのNPサンプルは使用前に超音波処理されました。使用した濃度は、500μg/ ml、250μg/ ml、100μg/ ml、および50μg/ mlでした。使用する濃度の範囲は、TiO ₂の濃度に従って決定されました。以前のレポートで見つかったNP（Dowdingetal。2014; Dowdingetal。2012; Gurretal。2005; Hirstetal。2009; Niu et al.2011）。 LSM NPは、ハンクスのソリューション（Invitrogen、CA、USA）で再構成された後、個別にテストされ、使用直前に約5分間超音波処理されました。

走査型電子顕微鏡

LSMNPを5μg/ mlに調製し、きれいなシリコンウェーハ上にドロップキャストし、風乾して残留水分を除去しました。 NPのサイズは、走査型電子顕微鏡（Gemini SEM、Zeiss）を使用して個別に確認されました。

細胞内活性酸素種の生成

活性酸素種（ROS）の生成は、CM-H2DCFDA色素（Invitrogen、CA、USA）の酸化を使用した蛍光顕微鏡によって評価されました[24]。細胞（1×105細胞/ウェル）を24時間培養した後、PBS溶液ですすいだ。 2μMの再構成CM-H2DCFDA色素を含むローディングバッファーを培地に30分間適用することにより、サンプルを染色しました。染色されたサンプルをPBSで3回洗浄し、細胞エステラーゼがAMまたはアセテート基を加水分解して色素を酸化に反応させるために5分間の回復時間を確保しました。次に、50μg/ mlで0〜500μg / mlの範囲の濃度のLSMNPを含むハンクスバッファーを、細胞とともに37°Cで15分間インキュベートした後、PBSで洗浄しました。細胞内で生成されたROSの蛍光画像をキャプチャし、さまざまな治療群と対照群の間の蛍光強度の増加率を計算することによって分析しました。

ミトコンドリアの損傷測定

ミトコンドリア内膜電位は、多色5,5 '、6,6'-テトラクロロ-1,1'、3,3'-テトラエチルベンズイミドアゾリル-カルボシアニオヨージド（JC-1 Sigma）を使用して評価されました[25]。 JC-1は、ミトコンドリア膜に組み込むことができる親油性蛍光カチオンであり、膜電位状態の凝集体に依存します。凝集により、JC-1の蛍光特性が変化し、緑色から赤色に変化します。 JC-1で染色された無傷のミトコンドリア膜は、蛍光顕微鏡で検出可能な顕著な赤色ミトコンドリア蛍光を示します。ミトコンドリア膜電位の崩壊は、その後の緑色蛍光の減少と赤色蛍光の増加をもたらします。 NP刺激の前に、細胞をPBSで2回洗浄し、培地中のJC-1染色試薬（1：1000）と37°Cで30分間インキュベートした後、PBSで洗浄して細胞を処理しました。ミトコンドリア膜電位は、10分間隔で蛍光顕微鏡によって検出されました。

[Ca ²⁺ の測定 ] _c

すべての実験は暗条件で実施されました。細胞にRhod-2AM色素（1μM）（ K _d =570 nM、λ_Ex =552 nm、およびλ_Em =581 nm）（Invitrogen、CA、USA）45分間。次に、細胞をPBSで2回洗浄した後、ハンクスバッファーでインキュベートし、適切なNP濃度で処理しました。すべてのCa ²⁺ シグナル伝達実験は、Nikon顕微鏡（Nikon Eclipse TE2000-U、東京、日本）に取り付けられた37°Cの温度調節状態で実施されました[24、25、27]（Chen et al.2011）。

ムチン分泌とELLA

細胞を1×10 ⁶ で播種しました 6ウェルプレートのウェルあたりの細胞数を24時間培養します。次に、気管一次電池をPBSでリンスし、PBSで調製した対応するLSM NP濃度（500μg/ ml、250μg/ ml、および100μg/ ml）で15分間刺激しました。分泌されたムチンを含む上清を収集し、8000 rpmで短時間遠心分離して、残留NPを除去しました。次に、上清を96ウェル（Nunc MaxiSorp、VWR、CA、USA）プレートで4℃で一晩インキュベートしました。その後、96ウェルプレートをPBST（PBS + 0.05％Tween-20）で洗浄し、1％BSAでブロックしました。 96ウェルプレートを再度PBSTで洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP; 5 mg / ml）（Sigma-Aldrich、MO、米国）、37°Cで1時間。基質である3,3 '、5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB; Sigma-Aldrich、MO、USA）を室温で各ウェルに添加し、続いてH ₂ SO ₄ （Sigma-Aldrich、MO、USA）反応を停止するため。光学密度は450nmで測定されました（Chenetal。2011; Kemp etal。2004）。

免疫吸着測定法（ELISA）の準備

細胞を1×10 ⁶ の密度で播種しました 6ウェルプレートで細胞密度を測定し、24時間培養しました。次に気管細胞をPBSですすいだ。 PBSで調製した適切なLSMNP濃度（0〜500μg / ml）で細胞を2時間刺激しました。細胞溶解はPeirceRIPA細胞溶解試薬によって調製され、溶解物は収集され、マイクロ遠心チューブに移されました。サンプルを約14,000× g で遠心分離しました 15分間、細胞の破片とNPをペレット化します。次に、上清を96ウェルプレートで4℃で一晩インキュベートしました。その後、96ウェルプレートをPBST（PBS + 0.05％Tween-20）で洗浄し、1％BSAでブロックしました。 96ウェルプレートを再度PBSTで洗浄し、ウサギ抗カスパーゼ3、活性型抗体（Millipore、ポリクローナル抗体）およびマウス抗シトクロムC（Invitrogen、モノクローナル抗体）と室温で2時間インキュベートしました。次に、二次抗体（抗ウサギおよび抗マウス結合西洋ワサビペルオキシダーゼ、HRP、ミリポア）を使用し、ELLAと同じ手順で吸光度を測定します[25]。

画像分析

画像解析は、倒立Nikon EclipseTE2000-U蛍光顕微鏡を使用して実行されました。各写真は×10の倍率で撮影され、Simple PCI（Compix Inc.、Imaging Systems、Sewickle、PA、USA）を使用して分析されました。細胞質ゾルのカルシウム濃度について示されたデータは、Rhod-2蛍光によって表されます。画像は0.5秒ごとに撮影され、分析のために自動的にグレースケールに変換されました。シンプルPCIは、選択した領域のピクセル強度（平均グレー値）を提供し、ナノ粒子刺激直後の100秒（〜200フレーム）にわたる200セルのフレームあたりの平均蛍光をそれぞれ示しました。免疫蛍光染色で示されたデータは、グラフェンの1〜2時間の処理後のタンパク質発現を表しています。すべての実験は、少なくとも3回独立して実施され、裏付けられました。