pH応答性ペルフルオロペンタン蛋白質ナノ粒子による卵巣腫瘍の標的超音波イメージングと治療

概要

本研究では、ペルフルオロペンタン（PFP）をフェリチン（FRT）にカプセル化し、腫瘍標的分子フォリック酸（FA）を共役させた多機能超音波（US）治療薬（FA-FRT-PFP）を開発しました。調製されたFA-FRT-PFPは平均粒子径42.8 ± 2.5 nm、ゼータ電位−41.1 ± 1.7 mVを示し、生理食塩水と温度条件で良好な安定性を示しました。FRTはpH感受性ケージ蛋白質で、pH 5.0で解離してポアを形成しPFPをロード可能。中性pHに戻すとポアが閉じ、PFPをFRT内にカプセル化しナノ粒子を形成します。pH 5.0条件下で、低強度集束超音波（LIFU、2 W/cm²）3分照射により、音響液滴気化（ADV）効果でFA-FRT-PFPのUS信号が有意に増強。同条件で4分照射ではFA-FRT-PFP生成気泡が破裂。FA-FRT-PFPは卵巣がん細胞へ効率的に標的送達され、LIFU 3分照射でUSコントラストが有意増強。LIFU 4分照射後、腫瘍細胞内への取り込み後のリソソーム酸性環境（pH 5.0）でのPFP放出、気泡化、LIFU照射下での気泡破裂による物理的衝撃波で細胞構造破壊と壊死を誘導し、細胞生存率が有意に低下。総合すると、FA-FRT-PFPは将来の臨床応用に向けた新規かつ有望なUSサーノスティクス（診断・治療一体化）薬剤であることを示しました。

はじめに

卵巣がんは世界で最も致死率の高い女性がんの一つです[1-3]。治療は依然として放射線療法、化学療法、手術、その他補助療法に臨床的に依存しています[4-6]。しかし、これらの戦略の短所が患者生存率改善を妨げ続けています。これらを克服するため、より効果的で安全な診断法が求められています。近年、イメージングと治療を単一治療プラットフォームに統合することがホットトピックとなっています[7-9]。

超音波（US）技術は非侵襲、非放射線、低コスト、特異性といった特徴により、臨床診断と腫瘍治療で広く用いられています[10-12]。近年、USイメージングと治療機能を持つ音響応答プラットフォーム（ARP）が効果的な腫瘍診断・治療のために開発されています[13-16]。ARPは主にマイクロバブル/ナノバブル（MB/NB）とナノ粒子（NP）ベースプラットフォームを含みます[16, 17]。これらARPの中で、MB/NBは良好な音響応答能力を持ちますが、サイズが大きいため生体組織透過性が弱く、サンプル安定性が劣ります。NPは小サイズにより強い組織透過性と長い薬物動態サイクルを示しますが、音響応答能力が限定的です。したがって、小サイズ、高安定性、強応答性を兼ね備えたARP設計が急務です。

液体フルオロカーボンは外部刺激に応じて液相-気相転移を起こします[18, 19]。Natalyaらは液体フルオロカーボン含有ナノエマルションを開発し、低強度集束超音波（LIFU）下で音響液滴気化（ADV）効果を発現させました[20-22]。エマルションは気泡形成と同時に薬物放出をトリガーし、腫瘍治療を可能にしました。しかし、液体フルオロカーボンを覆う封止材層により、腫瘍治療に必要な超音波強度と時間が増大し、周囲正常組織への損傷を招いていました。液体フルオロカーボンキャリアの更なる最適化が求められています。

本研究では、フェリチン（FRT）ナノ粒子に液体フルオロカーボン・ペルフルオロペンタン（PFP）をロードし、さらに腫瘍標的分子フォリック酸（FA）と共役させてFA-FRT-PFPを形成しました。フェリチンは高い生体適合性を持つ内因性ナノケージ蛋白質でpH感受性を示します[23-25]。酸性環境で解離し、アルカリ環境で再組立て可能。これによりpH変化に応じたフェリチンの制御されたロードと放出が可能です[26-28]。PFPは沸点29℃の頻用相転移材料。低沸点によりLIFUで容易に相転移可能で、HIFUより安全。PFPをフェリチンにロードし、FA-FRT-PFPは直径約47.3 ± 2.8 nmで生理食塩水と温度で高い安定性を示しました。結果によればFA-FRT-PFPには以下の利点があります：(1) pHを酸性から中性へ変化させることでPFPをFRTに容易ロード可能；(2) pH 5.0、LIFU（2 W/cm²、3分）下でFA-FRT-PFPがPFPを放出、相転移を起こしADVによりUSイメージング信号増強；(3) 長時間LIFU照射（4分）とpH 5.0下で、FA-FRT-PFPから放出されたPFPが爆発的気化し、物理的衝撃波で腫瘍細胞を壊死させ効果的破壊。我々の知る限り、これはPFPをFRTにロードした腫瘍USサーノスティクスの最初の例です。これら結果はFA-FRT-PFP + LIFUが統合的腫瘍診断・治療の新戦略であることを示します。

材料と方法

材料

アガロースゲル、フェリチン（FRT）、フォリック酸（FA）、ペルフルオロペンタン（C₃F₈、PFP）をSigma（米国ミズーリ州セントルイス）から購入。NH₂-PEG₂₀₀₀-FAとNH₂-PEG₂₀₀₀-COOHをXi'an Ruixi Biotechnology Co., Ltd.（中国）から供給。1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC）とN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）をThermo Fisher Scientific（米国マサチューセッツ州ウォルサム）から購入。Cell Counting Kit-8（CCK-8）をDojindo Laboratories（日本熊本）から入手。Dulbecco改変Eagle培地（DMEM）、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、ペニシリン-ストレプトマイシン、トリプシン-EDTA、胎児牛血清（FBS）をGibco（米国ニューヨーク州グランドアイランド）から購入。

細胞培養

ヒト卵巣がん細胞株SK-OV-3を中国科学院上海細胞生物学研究所から提供。正常卵巣上皮細胞HUM-CELL-0088をPriCells（中国武漢）から入手。細胞を10% FBS、1% ペニシリン-ストレプトマイシン含有DMEM培地で培養。5% CO₂、37℃、湿度制御インキュベーターで維持。

FA-FRT-PFP調製

まず、エステル化反応で標的分子FAをFRTに共役[29]。簡潔に、NH₂-PEG₂₀₀₀-FA（10 mg）とFRT溶液をEDC（5 mg/mL）とNHS（20 mg/mL）存在下で混合。室温で微弱攪拌しながら3時間反応後、透析（MWカットオフ1.2 kDa）で蒸留水対向24時間精製。得られた溶液がFA-FRTナノ粒子。次に、蛋白質の変性と再生プロセスでPFPをFRT空洞にロード[30]。簡潔に、FA-FRTを5 mL PBSに希釈し2 mg/mL、30分微弱攪拌でpH 5.0に調整しFRT完全解離を確保。その後、アイスバス下で500 μL PFPを添加、80 Wで5秒オン/5秒ポーズのパルス超音波処理をアイスバスで合計5分実施。超音波後、混合物pHを中性（pH 7.4）に調整。PFPは油状で水に不溶なため、過剰PFPを液分離で除去しFA-FRT-PFPを得る。FRT-PFPはNH₂-PEG₂₀₀₀-FAをNH₂-PEG₂₀₀₀-COOHに変更する以外同様に調製。

FA-FRT-PFPキャラクタリゼーション

ナノ粒子サイズとゼータ電位をZeta Sizer（Malvern、NanoZS、英国）で測定。FA-FRT-PFP形態を透過電子顕微鏡（TEM、Hitachi、日本）と倒立蛍光顕微鏡（Olympus、日本）で観察。ナノ粒子化学構造をフーリエ変換赤外分光法（Bruker Tensor 27、Bruker Optik、ドイツ）で検出。細胞取り込みを共焦点レーザー走査顕微鏡（LEXT OLS4100、Olympus、日本）で検出。FITC/PI二重染色細胞をフローサイトメトリー（BD、米国ニュージャージー州フランクリンレイクス）で解析。

pHと超音波応答性ガス生成性能

pH 5.0と7.5条件下のFA-FRT-PFPを、異なる音響強度LIFU（1.5と2.0 W/cm²）と異なる総時間（1、2、3、4分）でアガロースゲルモデルで照射、US装置（Esaote Mylab 90、イタリア）、周波数5-12 MHz、メカニカルインデックス（MI）0.06でUS像観察。その後、経時的に光学顕微鏡でFA-FRT-PFP外観観察。US像の関心領域US強度をImageJソフトウェアで解析。

細胞取り込み

簡潔に、FITC 1 mgをDMSO 1 mLに溶解、FRT-PFPとFA-FRT-PFPと混合、微弱攪拌で30分。透析で一晩脱イオン水で遊離FITCとDMSO除去しFITC標識ナノ粒子取得。次に、SK-OV-3と正常卵巣細胞（HUM-CELL-0088）を培地で24時間培養、遊離FITC、FITC標識FRT-PFP、FA-FRT-PFPをSK-OV-3細胞と5時間共培養。さらに、FITC標識FA-FRT-PFPをFA前処理SK-OV-3細胞と5時間インキュベート。細胞をPBSで3回洗浄、4%パラホルムアルデヒドで固定、0.2 mg/mL DAPI溶液で10分染色。共焦点レーザー走査顕微鏡で蛍光画像取得。蛍光シグナルをフローサイトメーターで定量。

in vitro超音波イメージング

SK-OV-3細胞をFAフリー培地で24時間培養後、PBS、FRT-PFP、FA-FRT-PFP、FA-FRT-PFP + FAを6時間インキュベート。細胞回収、アガロースゲルと混合、LIFU照射あり/なしで3分（1秒オン/1秒ポーズ、合計3分；1 MHz；2.0 W/cm²）。最後にUS像取得。

in vitro抗がん効果

SK-OV-3細胞を96ウェルプレートに1×10⁴ cells/well密度で播種、24時間付着待機。FA-FRT細胞毒性評価のため、各濃度（0、20、40、100、200、500 μg/mL）FA-FRTをSK-OV-3細胞と培養。24時間処理後、10% CCK-8含DMEM培地で20分インキュベート。450 nm吸光度をマルチモードプレートリーダー（Thermo Scientific）で測定し細胞生存率評価。さらに、SK-OV-3細胞と正常卵巣細胞（HUM-CELL-0088）をPBS、FRT-PFP、FA-FRT-PFP、FA-FRT-PFP + FAで3時間処理、LIFU照射（1秒オン/1秒ポーズ、合計4分；1 MHz；2.0 W/cm²）。処理細胞をさらに21時間培養。コントロールとしてLIFUなしでPBS、FRT-PFP、FA-FRT-PFP、FA-FRT-PFP + FAを24時間処理。処理細胞生存率をCCK-8アッセイで検出。

細胞死解析

細胞死タイプ評価のため、SK-OV-3細胞を6ウェルプレートに5×10⁴ cells/mL密度で播種。24時間後、PBS、FRT-PFP、FA-FRT-PFP、FA-FRT-PFP + FAで3時間処理、LIFU照射（1秒、1秒ポーズ、合計4分；1 MHz；2.0 W/cm²）。処理細胞をさらに23時間培養。コントロールとしてLIFUなしでPBS、FRT-PFP、FA-FRT-PFP、FA-FRT-PFP + FAを24時間処理。細胞をトリプシン化、1500×gで3分遠心、氷冷PBSで3回洗浄、200 mL結合バッファーで再懸濁。アネキシンV-FITC 5 μLとPI 10 μLを添加、暗所で15分インキュベート。染色細胞をフローサイトメーターで解析。

ウェスタンブロッティング

先行文献に従いウェスタンブロッティング実施。細胞を40 μg/mL PBS（コントロール）、FRT-PFP、FA-FRT-PFP + FA、FA-FRT-PFP（LIFU照射あり/なし、2.0 W/cm²、4分）で処理、さらに21時間培養。処理細胞をRIPAバッファー（Sigma）で溶解。各蛋白質50 μgをLaemmliサンプルバッファーで混合、5分沸騰、SDS-PAGE。蛋白質をセミドライTrans-Blot（Bio-Rad Laboratories）でPVDF膜（Bio-Rad Laboratories）に転写。ブロットをTBSブロッキングバッファー（2%脱脂乳または2% BSA、ホスホ特異的抗体用）で1時間室温インキュベート、一次抗体をTBST（0.1% Tween20、2% BSA含有）で希釈し4℃オーバーナイト反応。洗浄後、適切な二次抗体（Santa Cruz）をTBSTでインキュベート、SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate（Thermo）で検出。

統計解析

全データを平均±標準偏差で表示。Student's t-testで統計解析。*P < 0.05、**P < 0.01を統計的有意と判定。

結果と考察

FA-FRT-PFP調製とキャラクタリゼーション

FA-FRT-PFPを合成し腫瘍治療に用いました（図1）。相転移液滴をFRTのpH誘起可逆的解離と再組立てでロード。LIFU誘起ADVを持つPFPを細胞内へ送達し超音波イメージング薬剤として機能。図2a-cにFRT、FRT-PFP、FA-FRT-PFPのTEM像を示し、球状形態。FRT、FRT-PFP、FA-FRT-PFPの平均粒子径はそれぞれ6.9 ± 0.3 nm、43.8 ± 1.6 nm、47.3 ± 2.8 nm（図2d）、PFPロードとFA共役でFRTサイズ増大を示す。平均ゼータ電位はそれぞれ−43.2 ± 3.1 mV、−46.9 ± 2.2 mV、−41.5 ± 2.7 mV（図2e）。また、FA-FRT共役をFT-IRで評価（追加ファイル1: Figure S1）。FT-IRスペクトルで約1110 cm⁻¹に吸収帯（PEGのC-O-Cエーテル結合振動対応）、約1601 cm⁻¹と約1710 cm⁻¹に吸収ピーク（PEGとFRT由来のC=O振動、FAとFRTの-COOHと-CONH₂）、約2820、2920、2950 cm⁻¹にバンド（FAとPEGの-CH₂非対称・対称伸縮振動）、約1440 cm⁻¹に吸収ピーク（FAフェニル環関連）。結果はFA-FRT共役成功を確認。28日間保存期間で、水、PBS、生理食塩水、FBS中のFA-FRT-PFPサイズとPDIに有意変化なし（図3a, b）、優れた安定性を示す。図3cに25℃から45℃までの温度でのFA-FRT-PFPサイズ変化を示す。25-40℃でサイズほぼ不変、40℃以下で高安定性。45℃で42.1 nmから6 nmへサイズ変化、FA-FRT-PFP内PFPの激しい気化によるナノ粒子破壊が原因と推測。FA-FRT-PFP気化温度は通常圧下PFP気化温度29℃から45℃へ上昇、FRTシェル被覆によるものと推測[21, 31-33]。

FA-FRT-PFP合成概略と腫瘍サーノスティクス応用

a-c FRT、FRT-PFP、FA-FRT-PFPのTEM像。d, e サイズとゼータ電位分布

a, b 28日間の水、PBS、生理食塩水、FBS中でのFA-FRT-PFPサイズとPDI変化。c 25℃-45℃でのサイズ変化

pHとLIFU応答性US増強

FA-FRT-PFPのUSファントム実験を異なるpHとLIFU出力で実施。図4aに示すように、LIFU非照射時（pre）は全群でUS信号弱。pH 7.5、LIFU 3分照射後、1.5と2.0 W/cm²両方でFA-FRT-PFPは低US信号。一方、pH 5.0同照射時間ではより強いUS信号強度。FA-FRT-PFPが時間依存的・音響強度依存的ADV効果示すことを実証。これはpH 5.0でFA-FRT-PFPが解離しPFP放出、相転移しやすくなるため。興味深いことに、LIFU照射時間を4分に延長すると、pH 5.0、2.0 W/cm²でより弱いUS信号強度、LIFUが強すぎて気泡破裂誘導の可能性。これら結果はFA-FRT-PFPがpH 5.0、2.0 W/cm² LIFU照射でPFP放出、相転移、爆発を起こすことを示す。US強度結果を図4b, cに。図4d-gにpH 7.5と5.0、2.0 W/cm²、3分LIFU照射後のFA-FRT-PFP溶液形態を示す。pH 5.0、2.0 W/cm² LIFUでFA-FRT-PFPが大きな気泡生成、知見をさらに検証。

a 異なるpHとLIFU出力で照射したFA-FRT-PFP/アガロースゲルUS像。b, c aのUS信号統計データ。d-g 異なるpHと2.0 W/cm²、3分照射後の光学顕微鏡像

細胞取り込み

図5にFA-FRT-PFP細胞取り込み能を示す。遊離FITC処理細胞は微弱蛍光、FA-FRT-PFP標識後は強い蛍光シグナル、強い細胞取り込み能を示唆。FRT-PFP処理細胞とFA前処理FA-FRT-PFP処理細胞はより弱いFITC蛍光、FAがナノ粒子の能動標的化を高めることをさらに実証。また、FA-FRT-PFPはFCMで比較可能な取り込み挙動示す（図5c, d）。FA-FRT-PFP取り込み率46.5 ± 2.8%、遊離FITC（コントロール）、FRT-PFP、FA-FRT-PFP + FAより有意に高い。さらに追加ファイル1: Figure S2に正常卵巣細胞でのナノ粒子取り込み示す。FRT-PFP、FA-FRT-PFP + FA、FA-FRT-PFP群間で取り込みに有意差なし。正常卵巣細胞（HUM-CELL-0088）がSK-OV-3細胞比で低FA受容体発現であることが原因と推測。

細胞取り込み。a, b 遊離FITC、FITC標識FRT-PFP、FA-FRT-PFP + FA、FA-FRT-PFP処理細胞の共焦点蛍光像。緑と青はFITCとDAPI蛍光。スケールバー=25 μm。c, d 細胞内FITC蛍光シグナルと統計データ

in vitro超音波イメージング

FA-FRT-PFPがADVによりin vitroで超音波イメージング増強するか確認。ナノ粒子を細胞と5時間インキュベート、LIFU照射あり/なし（2.0 W/cm²）。図6aに示すように、LIFU非照射時は全テスト群でUS信号増強なし。照射後、FA-FRT-PFP処理細胞でコントロールFRT-PFPとFA-FRT-PFP + FA群比で高いUS強度。USイメージング定量解析でグレースケール値をImageJで計算。結果はUSイメージングデータと一致（図6b）、FA-FRT-PFP処理細胞のUS強度がLIFU照射（2.0 W/cm²、3分）で増強。FA-FRT-PFPが細胞内取り込まれ、リソソーム酸性環境（pH約5.0）で解離しPFPを細胞質放出[34, 35]。LIFU照射後、放出PFPが液滴から気体へ相転移しやすくなりUS強度増強。

in vitro超音波イメージング。a US像と統計データ（b）。PBS（コントロール）、FRT-PFP、FA-FRT-PFP + FA、FA-FRT-PFP処理細胞、LIFU照射あり/なし（2.0 W/cm²、3分）

in vitro抗がん効果と細胞死解析

図7aに0.5 mg/mLまでのFA-FRT-PFP細胞毒性。LIFU非照射時、FA-FRT-PFPはSK-OV-3細胞で明確な生存率抑制なし。CCK-8アッセイでFA-FRT-PFP+LIFU抗がん効果解析。図7bに示すように、LIFU非照射時はFRT-PFP、FA-FRT-PFP + FA、FA-FRT-PFP全てコントロール群比で顕著な細胞毒性なし。4分LIFU照射併用時、FA-FRT-PFPで有意な細胞毒性、FRT-PFP、FA-FRT-PFP + FAより高く、40 μg/mLでピーク細胞抑制率約90%に接近。これはFA-FRT-PFPがFRT-PFP、FA-FRT-PFP + FA比でより容易に細胞質、次いでリソソームへ取り込まれるためと推測。リソソーム酸性環境でFA-FRT-PFPがPFP放出、4分LIFU照射下でPFP気化、キャビテーションと破裂、一連の物理的衝撃力発生で腫瘍殺傷効果大幅増強[36-38]。さらに追加ファイル1: Figure S3に正常卵巣細胞でのナノ粒子細胞毒性示す。LIFU併用時、FRT-PFP、FA-FRT-PFP + FA、FA-FRT-PFP群間で細胞毒性に有意差なし。HUM-CELL-0088細胞が低FA受容体発現でFA標的効果示さないためと推測。

in vitro抗がん効果。a 異なる濃度FA-FRT-PFPで24時間インキュベート後SK-OV-3細胞生存率。b 40 μg/mL PBS（コントロール）、FRT-PFP、FA-FRT-PFP + FA、FA-FRT-PFP処理、LIFU照射あり/なし（2.0 W/cm²、4分）とさらに21時間培養後SK-OV-3細胞生存率

図8a, bに示すように、LIFU非照射時は全群で最小限の細胞死。4分LIFU照射後、FA-FRT-PFP処理細胞で有意な壊死（約91.6%）が他群比で観察、LIFU誘起PFPキャビテーションまたは気泡破裂による物理的衝撃波が原因。さらに追加ファイル1: Figure S4に細胞TNF蛋白発現レベル示す。LIFUなしでは細胞はTNF蛋白をほぼ発現せず。LIFUありでFA-FRT-PFP群がFRT-PFPとFA-FRT-PFP + FA群比で高いTNF発現、TNF蛋白がFA-FRT-PFP+LIFU誘導死関連重要蛋白であることを示唆[39]。優れたin vitroがん治療効果[40-42]に基づき、FA-FRT-PFPは将来的in vivoがん治療に有望。

a 40 μg/mL PBS（コントロール）、FRT-PFP、FA-FRT-PFP + FA、FA-FRT-PFP処理、LIFU照射あり/なし（2.0 W/cm²、4分）とさらに23時間培養後SK-OV-3細胞のフローサイトメトリー解析と統計データ

結論

まとめると、FA標的分子修飾FRTベースPFPロード相転移ナノ粒子（FA-FRT-PFP）を開発しました。新規標的USサーノスティクスとして、FA-FRT-PFPは複数の利点を持ちます：(1) ナノスケール粒子径；(2) FRTキャリアが酸性/中性条件で解離/再組立てしPFP液滴ロード/放出可能；(3) 酸性条件下3分LIFU補助でFA-FRT-PFPがPFP放出、ADVで相転移生成、USコントラスト有意増強；(4) 酸性環境下4分LIFU照射で放出PFPが細胞内「爆発効果」誘導、物理的抗腫瘍特性発現。これら結果はFA-FRT-PFPとLIFU補助が超音波分子イメージングと腫瘍治療の新戦略を提供することを示します。

データと材料の利用可能性

本論文の結論は本書に全て提示・示されたデータに基づいています。

略語

ADV:

音響液滴気化

ARP:

音響応答プラットフォーム

CCK-8:

Cell Counting Kit-8

EDC:

1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド

FA:

フォリック酸

FBS:

胎児牛血清

FITC:

フルオレセインイソチオシアネート

FRT:

フェリチン

LIFU:

低強度集束超音波

NHS:

N-ヒドロキシスクシンイミド

PFP:

ペルフルオロペンタン

US:

超音波