標的卵巣癌遺伝子治療のための機能化葉酸修飾酸化グラフェン/ PEIsiRNAナノ複合体

はじめに

卵巣がんは、世界の主要な婦人科の死因であり、通常、早期の診断と治療が困難なため、臨床転帰が不良と関連しています[1,2,3]。残念ながら、従来の化学療法剤は、非特異的分布、不十分なバイオアベイラビリティ、迅速な血液クリアランス、および生理学的環境への不十分な溶解性などの固有の制限を示します[4]。過去数十年にわたって、遺伝子治療は、癌を含むさまざまな遺伝性疾患の治療のための潜在的なアプローチとして調査されてきました[5、6、7、8]。しかし、安全で、非常に効率的で、選択的な遺伝子送達担体の欠如は、臨床的有用性への進歩を妨げてきました。現在、遺伝子ベクターにはウイルスベクターと非ウイルスベクターの2つのカテゴリーがあります。ウイルスベクターは高いトランスフェクション効率を示していますが、いくつかの欠点が臨床応用を制限しています。たとえば、重度の免疫炎症反応や野生型ウイルスとの組換えのリスクなどです[9、10]。対照的に、非ウイルスベクターは、広範な送達能力、低い免疫原性、および構造的柔軟性を有しており、ウイルスベクターの優れた代替物となっています[11、12、13]。ナノテクノロジーの急速な発展に伴い、遺伝子送達担体としての潜在的な使用のために多くのナノ粒子が探索されてきました[14、15]。ここで、この研究は、腫瘍組織に効率的に送達できる新しい非ウイルスベクターPEG-GO-PEI-FAを設計しました。

酸化グラフェン（GO）は、グラファイトの多段階酸化、超音波、および精製によって生成されるグラファイトの誘導体です[16]。 GO表面には、エポキシ、ヒドロキシル、およびカルボキシル基が含まれています[17]。その表面の酸素官能基は、GOに優れた生体適合性を与え、水および有機溶媒中で安定した懸濁液を形成し、化学修飾と官能化を促進します[18、19]。そのため、GOは、光熱癌治療、薬物および遺伝子送達、およびバイオセンサーに広く使用されています[20、21、22]。ポリエチレングリコール（PEG）は、安全で毒性のない生分解性の材料です。これは、米国食品医薬品局によって親水性薬物担体として承認されています[23]。 PEGによるGOの機能化は、生理学的条件下での安定性を改善し、体内のGOナノマテリアルのサイクルタイムを延長し、GOナノマテリアルの薬物動態を改善して腫瘍の標的化を改善します[24、25]。ポリエチレンイミン（PEI）は、さまざまな細胞株でのトランスフェクション効率が高いため、非ウイルスベクターのゴールドスタンダードになっています[26]。ただし、PEIは重度の細胞毒性と生体適合性が低いため、臨床応用が制限されます。この研究では、PEIをGOの表面にグラフトすると、細胞毒性の有意な低下が観察されました。葉酸受容体は、化学療法の前後の両方で、特に卵巣癌細胞において、さまざまな癌細胞表面で過剰発現しています[27]。標的遺伝子送達のために、葉酸分子はGOと共有結合して葉酸受容体を標的にしました。

全体として、本研究の主な目的は、卵巣癌に対するsiRNAベースの遺伝子治療の有用性を高めるための新しいターゲティングGOベースの遺伝子送達システムを探索することでした。得られた正に帯電したPEG-GO-PEI-FAには、遺伝子送達のためにsiRNAをロードすることができます。その成功した合成、特性評価、効果的な細胞内在化、およびインビトロ抗癌効果は、様々な技術を使用して分析された。さらに、このシステムの安全性もinvitroで評価されました。

材料と方法

資料

酸化グラフェンは、Suzhou Carbon Fung Graphene Technology Co. Ltd.（蘇州、中国）から入手しました。葉酸（FA）、 N -ヒドロキシスクシンイミド（NHS）およびフルオレセインイソチオシアネート（FITC）は、Sigma Aldrich Trading Co. Ltd.（上海、中国）から購入しました。分岐PEI25K、PEG（MW =2000）、アガロース、および1-（3-ジメチルアミノプロピル）-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（EDC・HCL）は、Adama Reagent Co. Ltd.（Shanghai、China）から購入しました。リン酸緩衝液（PBS）、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）、およびその他すべての化学物質は、Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd.（上海、中国）から購入しました。他のすべての化学物質は試薬グレードでした。 RPMI-1640培地（Gibco）、ウシ胎児血清（FBS）（Gibco）、トリプシン（Gibco）、および20×TAEバッファーは、Thermo Fisher Scientific Co. Ltd.（中国）から購入しました。細胞計数キット8（CCK-8）は、Shanghai Yisheng Biological Co. Ltd.（Shanghai、China）から購入しました。 LysoTrackerRed、4％パラホルムアルデヒド、4'-6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）、およびLipofectamine 2000トランスフェクション試薬は、Invitrogen Co. Ltd.（中国）から購入しました。 Dil蛍光プローブ（カタログ番号：C1036）はBeyotime Co. Ltd.から購入しました。Anti-PLK1（PLK1-homo-581）短鎖干渉RNA（siRNA）は、Shanghai GenePharma Co. Ltd.（Shanghai、China）によって合成されました。

PEG-GO-PEI-FAの準備

PEG-GO-PEI-FAの合成は、図S2（A）に示す戦略に従います。まず、10 mLのGO水性懸濁液（1000μg/ mL）を50Wで2時間連続的にバス超音波処理しました。次に、1 mLのEDC・HCL（5000μg/ mL）とNHC（5000μg/ mL）を加え、100 Wで30分間断続的に超音波処理した後、30分間超音波処理したPEG（10 mg）を加え、マグネチックスターラーで攪拌しました。 0°Cで6時間攪拌します。未反応の試薬を除去してGO-PEG溶液を得るには、混合物を透析膜（MWCO、3500 Da）を使用して蒸留水中で24時間透析しました。次に、GO-PEG溶液を30分間超音波処理し、1 mLのEDC・HCL（5000μg/ mL）とNHC（5000μg/ mL）を添加し、再度30分間超音波処理した後、PEI 25K（5000μg/ mL）を添加しました。 ）2mL。混合物を30分間超音波処理し、0℃で6時間撹拌した。続いて、PEG-GO-PEIを得るために、混合物を再び透析膜（MWCO、3500 Da）を用いて蒸留水中で24時間透析した。 PEG-GO-PEI溶液を60分間超音波処理し、1 mLのEDC・HCL（5000μg/ mL）とNHC（5000μg/ mL）を加えて再度30分間超音波処理した後、溶液に10mgのFAを添加しました。 。溶液を30分間超音波処理し、0℃で12時間撹拌し、48時間透析して、上記の手順に従ってPEG-GO-PEI-FAを得た。ナノコンプレックスの溶液を真空凍結乾燥機（Biosafer-10D）で乾燥させました。

特性評価

水溶液でのナノ複合体の表面ゼータ電位と平均粒子サイズは、動的光散乱法（DLS、Malvern Zetasizer Nano ZS、英国）によって測定されました。ナノ複合体の形態は、大気中で原子間力顕微鏡（AFM、MuLtimode Nanoscope IIIa、ドイツ）を使用して観察されました。フーリエ変換赤外分光法（FTIR）スペクトルは、400〜4000 cm ^-1 の範囲でKBrペレットを使用して、Thermo Nicolet 6700FTIR分光器によって取得されました。 。ナノ複合体のUV-Vis吸収スペクトルは、UV-Vis分光光度計（UV、EV300、USA）によって測定されました。ナノ複合体のラマンは、532 nmの励起波長で分散ラマン顕微鏡（Senterra R200-L、ドイツ）によって測定されました。

インビトロバイオセキュリティアッセイ

SKOV3（ヒト卵巣癌細胞）はKeygen（中国）から購入しました。細胞は、10％FBS、100 U / mLペニシリン、100 g / mLストレプトマイシンを添加したRPMI-1640培地で維持し、5％CO ₂ を含む加湿雰囲気下で37°Cで培養しました。 。この研究では、材料の細胞毒性をCCK-8アッセイによってSKOV3細胞で分析しました。簡単に説明すると、細胞を96ウェルプレートに6×10 ³ の密度で播種しました。 10％FBSを含む100μLの1640培地で細胞/ウェルを培養し、5％CO ₂ を含む加湿雰囲気下で37°Cで12時間インキュベートします。 。次に、GO、GO-PEG、PEG-GO-PEI、およびPEG-GO-PEI-FAを10〜1000μg / mLの範囲の最終濃度で添加し、細胞とともにさらに12時間インキュベートしました。別のGO、GO-PEG、PEG-GO-PEI、およびPEG-GO-PEI-FAは、100μg/ mLの濃度で4〜24時間の異なる時間でインキュベートされました。続いて、10μLのCCK-8を各ウェルに添加し、37℃でさらに3時間インキュベートしました。その後、マイクロプレートリーダーで450nmの吸光度を測定しました。各グループ実験を3回繰り返した。培地で培養されたコントロール細胞に関連する相対的な細胞生存率（％）は、（サンプルの吸光度-ブランクの吸光度）/（コントロールの吸光度-ブランクの吸光度）×100％として計算されました。

アガロースゲル遅延アッセイ

20×TAE緩衝液をDEPC処理水で希釈して1％アガロース溶液を作成しました。次に、溶液を電子レンジで5分間加熱してアガロースを完全に溶解させた。アガロース溶液の温度が55°Cに下がったら、10,000：1の体積比の臭化エチジウム（EB、0.5μg/ mL）溶液を加えて均一に混合し、続いて冷却してアガロース溶液を冷却してアガロースゲルを形成しました。 。異なる重量比のPEG-GO-PEI、PEG-GO-PEI-FA、およびsiRNA混合物を穴に加えた。ゲルを110Vおよび40mAで約60分間泳動した後、紫外線イメージャーで観察および分析しました。

PEG-GO-PEI-FAの細胞取り込み研究

細胞への取り込みを調べるために、ナノ複合体を、少し変更を加えた前述の方法に従ってFITCで標識しました[28]。簡単に説明すると、ナノ複合体の溶液（約1 mg / mL、2.0 mL）をDMSOに溶解した0.2 mLのFITC（26 mM）と混合し、室温で一晩撹拌しました。得られた混合物を5000MWCOメンブレンで透析して非標識FITCを除去し、凍結乾燥しました。細胞を6ウェルプレート（カバースリップを含む）に2×10 ⁵ の密度で播種しました。 10％FBSを含む2 mLの1640培地で細胞/ウェルを培養し、細胞培養インキュベーター内で37℃で12時間インキュベートします。次に、各ウェルの培地を無血清1640培地に交換しました。続いて、細胞を異なるナノ複合体/ FITCで処理した。ナノコンプレックスなしで処理された細胞は対照群であり、PEI25Kで処理された細胞は並行対照群です。 5％CO ₂ を含む加湿雰囲気下、37°C​​で4時間インキュベートした後 、培養プレートの液体を除去し、細胞を冷DPBS（pH =7.4）で2回洗浄した後、20μLのDAPIと5μLのDil（細胞膜色素）を各ウェルに添加し、37°C​​で20分間インキュベートしました。暗い。続いて、培地のDAPIおよびDilを除去し、冷DPBS（pH =7.4）で2回洗浄し、細胞のカバーガラスを取り出し、PermountTMマウンティング培地でスライドガラスに固定しました。その後、細胞のスライドの蛍光シグナルを共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）で観察し、ナノ複合体の細胞取り込みを分析しました。

エンドソームからの脱出と核への侵入

細胞分布、エンドソーム脱出、およびナノ複合体の浸透を視覚化するために、SKOV3細胞を1×10 ⁵ の密度で12ウェルプレート（カバースリップを含む）に播種しました。 10％FBSを含む2 mLの1640培地に細胞/ウェルを入れ、12時間インキュベートします（37°C、5％CO ₂ ）。次に、各ウェルの培地を1 mL /ウェルの無血清1640培地に交換しました。続いて、FITCで標識されたさまざまなナノ複合体（100μg/ mL）を12ウェルプレートに1 mL /ウェルで添加しました。 6時間後、液体を除去し、細胞を冷DPBS（pH =7.4）で2回洗浄し、12ウェルプレートにLysoTracker Red（5μg/ mL）を50μL/ウェル添加しました。 5％CO ₂ を含む加湿雰囲気下、37°C​​で15分間インキュベートした後 、12ウェルプレートの液体を除去し、細胞を冷DPBS（pH =7.4）で2回洗浄した後、20μLのDAPIを各ウェルに添加し、暗所で4°Cで20分間インキュベートしました。次に、DAPI液体を除去し、冷DPBS（PH =7.4）で2回洗浄しました。その後、4％パラホルムアルデヒドを室温で15分間固定し、カバーガラスを取り出して、Permount TM MountingMediumを使用してスライドガラスに固定しました。スライドの蛍光シグナルは、共焦点レーザー走査顕微鏡で観察され、リソソームの脱出とナノ複合体の核への浸透を分析しました[29]。

細胞抑制分析

CCK-8アッセイを使用して、PEG-GO-PEI / siRNAおよびPEG-GO-PEI-FA / siRNAの細胞阻害効果を分析しました。間もなく、細胞を96ウェルプレートに6×10 ³ の密度で播種しました。 10％FBSを含む100μLの1640培地で細胞/ウェルを培養し、5％CO ₂ を含む加湿雰囲気下で37°Cで12時間インキュベートします。 。次に、PEG-GO-PEIおよびPEG-GO-PEI-FAを10〜500μg / mLの範囲の最終濃度で添加し、細胞とともにさらに12時間および24時間インキュベートしました。次に、PEG-GO-PEI / siRNAおよびPEG-GO-PEI-FA / siRNAを、100μg/ mLの濃度で4〜48時間細胞とインキュベートしました。 siRNAにLipofectamine2000をトランスフェクトし、コントロールグループとして未処理にしました。続いて、10μLのCCK-8を各ウェルに添加し、37℃でさらに3時間インキュベートしました。吸光度は450nmで測定されました。各グループ実験を3回繰り返した。阻害率（％）は、1-（サンプルの吸光度-ブランクの吸光度）/（コントロールの吸光度-ブランクの吸光度）×100％として計算されました。

統計

各実験テストは3回繰り返され、データはSPSS17.0ソフトウェアを使用して分析されました。複数グループ分析および対になっていない学生の t のための一元配置分散分析テスト 比較には、2グループ分析のテストを使用しました。データは平均および標準偏差（SD）として表され、統計的有意性は p に設定されました。 <0.05。

結果と考察

PEG-GO-PEI-FAの合成

FRの発現は、最初に、Cancer Cell Line Encyclopedia（CCLE;http://portals.broadinstitute。org/ ccle）データベース[30]に基づくさまざまな癌細胞株と、Gene Expression ProfilingInteractiveに基づくさまざまな卵巣組織で分析されました。分析（GEPIA2; http://gepia2.cancer-pku.cn）データベース[31]。結果は以前の研究と一致していました（図S1）。したがって、遺伝子送達のターゲティングリガンドとしてFAを選択しました。

酸化グラフェンは確かに、エッジのカルボキシル基、ヒドロキシル基、酸化プロセスによって生成された基底面のエポキシ基など、多くの酸素含有基を持っています[32]。ナノスケールのGO（NGO）を取得するために、図S2（A）に示すように、GOを50 Wで2時間のバス超音波処理によって連続的に分解し、続いてEDC / NHS化学を使用してPEG / PEI / FAをGOに共有結合させました。図S2（B）は、PEG-GO-PEI-FA / siRNAの処理経路を示しています。化学共役の分析は、スペクトル吸収ピークを取得するためにFTIR微分スペクトル技術によって実行されました[33]。図1aに示すように、OHの存在（3425 cm ^-1 ）、C =O（1719 cm ^-1 ）、およびC =H（1350 cm ^-1 ）官能基はGOで発見され、GOの表面にヒドロキシルとカルボキシルが存在することを示しました。 CH（2885 cm ^-1 ）PEGが安定した共有結合を介してGOと反応したときに、伸縮振動バンドを見つけることができました。これは、PEGがGOにグラフトされていることを示しており、PEG結合効率は約6％でした。 PEIとFAがGOと反応した後、NH（1590 cm ^-1 ）、C–N（1420 cm ^-1 ）伸縮振動バンドが観察され、PEIとFAがエステル化によってGOにグラフトされたことを示しています。これらの結果は、共役PEG-GO-PEI-FAが正常に合成されたことを示しています。

フーリエ変換赤外分光法（FTIR）とUV-Vis分光光度計を使用したPEG-GO-PEI-FAの合成分析の成功。 a GO、GO-PEG、PEG-GO-PEI、およびPEG-GO-PEI-FAのFTIRスペクトル。 b GO、FA、GO-PEG、PEG-GO-PEI、およびPEG-GO-PEI-FAのUV-Vis吸収スペクトル

図1bは、GO、FA、GO-PEG、PEG-GO-PEI、およびPEG-GO-PEI-FAのUV-Vis吸収スペクトルを示しています。 GOの吸収ピークは223nmでした。 FAの吸収ピークは275nmでした。 GO-PEGは滑らかな曲線を示し、PEGがGOと結合し、GOの山がより滑らかになったことを示しています。 PEG-GO-PEIは219nmに吸収ピークがあり、PEIがGO-PEGの表面にグラフトされたことを示しています。 PEG-GO-PEI-FAの吸収ピークは219nmと275nmであり、FAがPEG-GO-PEIにグラフトされていることがわかります。これらの結果はすべて、PEG-GO-PEI-FAの合成が成功したことをさらに示しています。

PEG-GO-PEI-FAの特性評価

表1に示すデータは、ナノ複合体の粒子サイズとゼータ電位を示しています。ナノ複合体の粒子サイズは徐々に218.4nmに増加し、PEG、PEI、およびFAはGOの表面に徐々にグラフトされました。 PEIをGOに接続すると、ゼータ電位が-16.5から+ 17.5 mvに変化し、静電相互作用と細胞への取り込みを介して負に帯電したDNAまたはRNAを吸着する能力が促進されました。 PEG-GO-PEI-FAおよびPEG-GO-PEI-FA / siRNAのゼータ電位はそれぞれ+ 14.7mvおよび+ 14.5mvでした。ゼータ電位は、FAおよびsiRNAの負電荷のために、PEG-GO-PEI-FAまたはPEG-GO-PEI-FA / siRNAがPEG-GO-PEIよりも小さいことを明らかにしました。これらは、PEG-GO-PEI-FA / siRNAが電荷相互作用によって細胞の表面に吸着され、細胞膜上の受容体を介したエンドサイトーシスによって使用される可能性があることを示しています[34]。

ナノキャリアの表面形態と粒子サイズもAFMとDLSによって測定されました。図2aに示すように、GOは192.1nmの粒子サイズで滑らかな表面とシート構造を示しました。 GOの表面にPEG、PEI、FAをグラフトした後、PEG-GO-PEI-FAの粒子サイズは216.1 nmに増加し、PEG-GO-PEI-FAの表面に多くの隆起が観察されました（図2b）。 ）、多数の装飾がGOシートに固定化されたことを示唆しています。同時に、PEG-GO-PEI-FAの高さはGOよりも高くなりました。これは主に、GOシートの両方の平面にPEG、PEI、およびFAが付着しているためです。

ナノスケールデリバリーシステムの特性評価。原子間力顕微鏡（AFM）と動的光散乱（DLS）を使用して、形態とサイズ分布を特徴付けました。 a GOと b PEG-GO-PEI-FA。 GO、GO-PEG、およびPEG-GO-PEIの生成された酸化グラフェン表面の分析のためのラマンスペクトル c

ラマン分光法は、ナノカーボン材料の特性評価と構造特性を測定するために最も一般的に使用されるものの1つです[35]。図2cに示すように、GOのラマンスペクトルは1600 cm ^-1 に振動バンドを示しました。 （Gバンド）および1354 cm ^-1 （Dバンド）、ID / IGの面積比は1.0385であり、部品SP ² GOの混成は壊れており、ヒドロキシルとカルボキシルを形成していました。 GO-PEGおよびPEG-GO-PEIは、1595 cm ^-1 で振動バンドを示しました。 （Gバンド）および1352 cm ^-1 （Dバンド）、ID / IGの面積比は0.7737と0.5238でした。 ID / IGの面積比は、GOとのPEGおよびPEI反応に続いて徐々に減少しました。これは、PEGとPEIがGOの表面にグラフトされたことを示しています。

さまざまな機能性NGOのinvitroバイオセキュリティ分析

非ウイルス性遺伝子ベクターのバイオセキュリティの問題は、臨床応用への重要な課題であり続けています。高い正電荷は、遺伝子を凝縮および保護する優れた能力をもたらしただけでなく、重度の細胞毒性をもたらしました[36、37]。遊離siRNAナノ複合体の細胞毒性をテストするために、さまざまな濃度（10〜1000μg / mL）の遊離ナノ複合体とともに4、8、12、および24時間インキュベートしたSKOV3細胞を用いてCCK-8アッセイを実施しました。図S3に示すように、ナノ複合体は、1000μg/ mLおよび24時間で卵巣癌において依然として高い細胞生存率を示しました。すべてのナノ複合体の細胞毒性は、時間および濃度依存的に示されました（SKOV3細胞の生存率：1000μg/ mLのすべてのナノ複合体で84.38％以上、24時間ですべてのナノ複合体で94.21％以上） SKOV3セルを使用）。これらの結果は、ナノ複合体がごくわずかな細胞毒性を示し、生体適合性遺伝子ベクターとして機能する可能性があることを示唆しています。

siRNAと組み合わせたナノ複合体の分析

遊離RNA分子の細胞への取り込みは、それらが担っている実質的な負電荷のために通常注意が必要です[38]。カチオン性ポリマーによる負に帯電した生体分子のローディングは、問題を解決するために広く採用されています[39]。この論文では、PEG-GO-PEI-FAベクターへのsiRNAのロードは、水溶液中でsiRNAとPEG-GO-PEI-FAを混合することによって達成されました。表1に示すように、PEG-GO-PEI-FAのゼータ電位は+14.7 mVであり、静電相互作用によってsiRNAがPEG-GO-PEI-FAの表面に吸着されることを示しています。この研究では、ナノ複合体の遺伝子凝縮能力をアガロースゲル電気泳動によって評価しました[40]。図3aは、PEG-GO-PEIが10の重量比でsiRNAに対して明らかな凝縮能力を示したのに対し、PEG-GO-PEI-FAは重量比が20に達するとsiRNAの移動を完全に遅らせることが観察されました（図3b）。したがって、PEG-GO-PEI-FAはsiRNAを分解から保護することができますが、同時に、良好な結合能力を示すためにもう少しナノ複合体が必要です。これは、それほど高くなかったPEG-GO-PEI-FAのゼータ電位に関連している可能性があります。これらの結果は、PEG-GO-PEIおよびPEG-GO-PEI-FAが十分な送達能力を有し、特にPEG-GO-PEI-FAが遺伝子の効率的かつ安全な送達のための有効なベクターとしての可能性をさらに示したことを示した。 / P>

さまざまな重量比でのsiRNAローディング能力。 siRNAとナノキャリア間の相互作用を評価するために、アガロースゲル遅延アッセイを実施しました。 a PEG-GO-PEIおよび b さまざまな重量比（材料/ siRNA）でのPEG-GO-PEI-FA

細胞取り込み分析

保因者が遺伝子送達のために腫瘍を特異的に標的にすることができるかどうかは非常に重要です。 PEG-GO-PEI-FAキャリアが細胞に容易に侵入できるかどうかを確認するために、細胞内イメージング用の蛍光プローブとしてFITCを使用しました。同時に、核はDAPIで染色され、細胞膜はDilで染色されました。図4に示すように、コントロールグループとPEG-GO-PEIグループは核と細胞膜の周りに緑色の蛍光シグナルを示しませんでした。これは、PEG-GO-PEIがセルに侵入しなかったことを意味します。 PEI25KおよびPEG-GO-PEI-FA / siRNAは、コアの周りに緑色の蛍光シグナルとして現れました。これは、PEG-GO-PEI-FAが細胞膜に浸透して細胞に侵入する可能性があることを明確に示しています。 PEG-GO-PEI-FAナノ複合体は、最も活発な細胞取り込みを示しました。おそらく、FAは、SKOV3細胞の表面で過剰発現したFRに特異的に結合できるためです。これらの結果は、FAがPEG-GO-PEI-FAおよびPEG-GO-PEI-FA / siRNAナノ複合体の効率的な細胞取り込みを媒介する上で重要な役割を果たしたことを示唆しました。さらに重要なことに、FAがその受容体に結合する能力は、共有アミド結合の影響を受けず、受容体を介したエンドサイトーシスは妨げられませんでした。

さまざまなナノ複合体の細胞への取り込み。 4時間のインキュベーション後のヒト卵巣癌SKOV3細胞におけるFITC標識された異なるナノ複合体の細胞取り込みの共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）画像。青、核（DAPIラベル付き）;赤、細胞膜（Dil標識）;緑のナノ複合体（FITCラベル）。スケールバーは100μmを表しますが、単一セルではスケールバーは10μmです

リソソームエスケープ分析

siRNAデリバリーシステムの場合、エンドソームまたは形成されたリソソームから脱出する必要があります。ただし、そうでない場合、siRNAは分解するか、細胞から排出されます[41、42、43]。 CLSMを使用してナノ複合体の細胞内局在化によってエンドソーム脱出能力を評価します。多くの報告がPEI25Kが「プロトンスポンジ効果」によってエンドソームまたはリソソームの脱出を促進できることを示しているため[44]、PEI25Kを対照として使用しました。この研究では、ナノ複合体をFITCで標識しました。まず、FITCの緑色蛍光シグナルがLyto Tracker Redの赤色蛍光シグナルと重なっているという黄色のシグナルによって、ナノ複合体がリソソームに入ると推定しました。 PEI 25Kは、細胞との4時間のインキュベーション後に黄色のシグナルとして現れ、他の物質は、細胞との2時間のインキュベーションの後に黄色のシグナルとして現れ、物質が細胞に入ったことを意味します（図5）。ナノ複合体が明るいシアンの信号によってリソソームから逃げるかどうかにかかわらず、FITCの緑色の蛍光信号はDAPIの青色の蛍光信号と結合します。図5aに示すように、核内の蓄積に緑色のシグナルが観察され、PEI / siRNAを細胞と8時間インキュベートした後、明るいシアンのシグナルがあり、PEI / siRNAがリソソームから脱出したことを示しています。しかし、PEG-GO-PEI-FAおよびPEG-GO-PEI-FA / siRNAには、2時間という早い時期に核に浸透する弱い緑色のシグナルがあり、インキュベーション時間の増加とともに、より緑色のシグナルが核に蓄積しました。また、PEG-GO-PEI-FAおよびPEG-GO-PEI-FA / siRNAを細胞とともに4時間インキュベートすると、明るいシアンのシグナルが発生しました（図5b、c）。これらは、物質が非常に早くリソソームから脱出したことを示していました。一言で言えば、これらの結果は、PEG-GO-PEI-FAおよびPEG-GO-PEI-FA / siRNAが優れたエンドソームまたはリソソーム脱出能力を維持し、invitroでリソソーム脱出および遺伝子トランスフェクションを効率的に促進できることを示しました。

CLSMによって観察されたPEG-GO-PEI-FAの細胞内在化とリソソーム脱出。 a とインキュベートしたSKOV3卵巣がん細胞 PEI、 b PEG-GO-PEI-FA、および c 0.5、1、2、4、および8時間のPEG-GO-PEI-FA。青はDAPIで染色された核、緑はFITCで標識されたナノ複合体、赤はLysoTracker赤で染色した後のエンドソームとリソソームの蛍光を表しています。スケールバーは100μmを表しますが、単一セルではスケールバーは10μmです

PEG-GO-PEI-FA / siRNAの細胞抑制性評価

現在のケースでは、PEG-GO-PEI-FA / siRNAの治療効果は、invitroでSKOV3細胞に対するCCK-8アッセイによって調べられました。図6aに示すように、PEG-GO-PEI-のさまざまな濃度（10〜100μg / mL）およびさまざまな時点（12および24 h）での腫瘍細胞の生存率に有意な影響は見られませんでした。 FAグループ。濃度が100μg/ mLを超えていたにもかかわらず、腫瘍細胞の生存率は80％以上でした。そこで、次の細胞抑制性研究のために100μg/ mLを選択しました。 PEG-GO-PEI / siRNAおよびLipo2000 / siRNAグループでは細胞毒性が弱かった（阻害率は20％未満）。 PEG-GO-PEI / siRNAおよびLipo2000 / siRNAと比較して、PEG-GO-PEI-FA / siRNAはSKOV3腫瘍細胞の増殖に対して有意な阻害効果を示しました。 PEG-GO-PEI-FA / siRNAは時間依存的にSKOV3細胞を阻害しました（図6b）。これらの結果は、PEG-GO-PEI-FA / siRNAが腫瘍細胞の増加に対して最良の阻害効果を示し、遺伝子送達の理想的なナノキャリアとしてPEG-GO-PEI-FAを使用できることを示しています。

In vitro cytotoxicity of PEG-GO-PEI-FA/siRNA in ovarian cancer SKOV3 cells via CCK-8 assay. a SKOV3 cells were treated with PEG-GO-PEI and PEG-GO-PEI-FA at different concentrations (10–500 μg/mL) at 12 and 24 h to get the optimal dose of nanocarrier. b The cytotoxicity of PEG-GO-PEI-FA/siRNA, PEG-GO-PEI/siRNA, and Lipo2000/siRNA were measured in different time points (4–48 h) at 100 μg/mL. Error bars represent ± SD; * p <0.05 (Student’s t test)

結論

In this study, we successfully synthesized a novel gene delivery system, PEG-GO-PEI-FA. The not cytotoxic by itself and excellent biological compatibility of PEG-GO-PEI-FA guaranteed its prospects as a safe and effective gene delivery vector. PEG-GO-PEI-FA/siRNA nanocomplexes exhibited outstanding physicochemical properties for gene targeting delivery. Moreover, PEG-GO-PEI-FA/siRNA could readily enter SKOV3 ovarian cancer cells and escape from the lysosomes. Cytotoxicity assay demonstrated that PEG-GO-PEI-FA/siRNA had a good inhibition effect on ovarian cancer cells in a time-dependent manner, and it exhibited a higher cytotoxicity effect compared to other groups. On the basis of aforementioned results, PEG-GO-PEI-FA may provide good anticipation as a gene vector for targeted gene delivery and more effective strategy in ovarian carcinoma treatments.

データと資料の可用性

この調査中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された記事とその補足情報ファイルに含まれています。

略語

AFM：

原子間力顕微鏡

CCK-8：

Cell counting kit8

CCLE:

Cancer cell line encyclopedia

CLSM：

Confocal laser scanning microscope

DAPI：

4′-6-Diamidino-2-phenylindole

DLS：

動的光散乱

DMSO：

ジメチルスルホキシド

DPBS:

Dulbecco’s phosphate-buffered saline

EB：

Ethidium bromide

EDC∙HCL:

1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethyl carbodiimide hydrochloride

FA：

葉酸

FBS：

ウシ胎児血清

FITC：

フルオレセインイソチオシアネート

FITR:

フーリエ変換赤外分光法

FR：

Folate receptor

GEPIA:

Gene expression profiling interactive analysis

GO：

酸化グラフェン

MWCO:

Molecular weight cutoff

NGO:

Nanoscale graphene oxide

NHS：

N -ヒドロキシスクシンイミド

NP：

ナノ粒子

PBS：

Phosphate-buffered solution

PDI：

多分散度指数

PEG：

ポリエチレングリコール

PEI：

ポリエチレンイミン

siRNA：

低分子干渉RNA