葉酸修飾グラフェン酸化物/PEIナノコンプレックスによる卵巣がんへの標的siRNA送達

概要

遺伝子治療は、スモールインターフェリングRNA（siRNA）を含む卵巣がん治療の有効な手法として浮上しています。その強力さにもかかわらず、標的化された効率的な遺伝子送達システムが少なく、遺伝子治療の発展を深刻に阻害しています。本研究では、グラフェン酸化物（GO）を官能基化して新規遺伝子ベクターPEG-GO-PEI-FAを合成しました。葉酸（FA）は、卵巣がんで過剰発現している葉酸受容体（FR）に特異的に結合できます。ナノコンプレックスの特性は、動的光散乱（DLS）、原子間力顕微鏡（AFM）、フーリエ変換赤外分光法（FTIR）で評価しました。アガロースゲル電気泳動でsiRNA凝縮能と安定性を評価しました。卵巣がん細胞での細胞取り込み効率とリソソーム脱出能を共焦点レーザー走査顕微鏡で調査しました。さらに、CCK-8アッセイでシステムの細胞生物学的安全性とsiRNA耐性の阻害効果を評価しました。PEG-GO-PEI-FAナノコンプレックスのサイズは216.1±2.457nmで、卵巣がん細胞に対して軽度の細胞毒性を示しました。高い取り込み効率で、PEG-GO-PEI-FAはリソソームから速やかに脱出し遺伝子を放出できます。さらに、PEG-GO-PEI-FA/siRNAは卵巣がん細胞の増殖を効果的に阻害します。総じて、PEG-GO-PEI-FA/siRNAはFR陽性卵巣癌や類似腫瘍の治療におけるsiRNA送達の有望な戦略を提供する可能性があります。

はじめに

卵巣がんは世界中で婦人科がん死の主要原因であり、早期診断と治療の困難さから通常不良な臨床転帰と関連しています[1-3]。残念ながら、従来の化学療法剤は非特異的分布、低バイオアベイラビリティ、急速な血中クリアランス、生理環境での低溶解性などの固有の限界を持っています[4]。過去数十年間、遺伝子治療はがんを含むさまざまな遺伝性疾患の治療法として研究されてきました[5-8]。しかし、安全で高効率、選択的な遺伝子送達キャリアの欠如が臨床応用への進展を妨げています。現在、遺伝子ベクターにはウイルスベクターと非ウイルスベクターの2種類があります。ウイルスベクターは高いトランスフェクション効率を示しますが、重度の免疫炎症反応や野生型ウイルスとの再組み換えリスクなど、いくつかの欠点が臨床応用を制限しています[9, 10]。対照的に、非ウイルスベクターは広範な送達容量、低免疫原性、構造的柔軟性を持ち、ウイルスベクターの優れた代替となります[11-13]。ナノテクノロジーの急速な発展に伴い、多くのナノ粒子が遺伝子送達キャリアとしての潜在的用途で探求されています[14, 15]。ここで、腫瘍組織に効率的に送達できる新規非ウイルスベクターPEG-GO-PEI-FAを設計しました。

グラフェン酸化物（GO）は、黒鉛の多段階酸化、超音波処理、精製によって生成される黒鉛の誘導体です[16]。GO表面にはエポキシ、水酸基、カルボキシル基が含まれています[17]。表面の酸素官能基によりGOは優れた生体適合性を持ち、水および有機溶媒で安定な懸濁液を形成し、化学修飾と官能基化を容易にします[18, 19]。したがって、GOは光熱がん治療、薬物・遺伝子送達、バイオセンサーに広く使用されています[20-22]。ポリエチレングリコール（PEG）は安全、無毒、生分解性材料であり、米国FDAによって親水性薬物キャリアとして承認されています[23]。GOのPEG官能基化は、生理条件下での安定性向上、体内でのGOナノ材料の循環時間延長、薬物動態改善による腫瘍標的化向上をもたらします[24, 25]。ポリエチレンイミン（PEI）は、さまざまな細胞株で高いトランスフェクション効率を持つため非ウイルスベクターのゴールドスタンダードとなっています[26]。しかし、PEIは重度の細胞毒性と低い生体適合性を示し、臨床応用を制限しています。本研究では、PEIをGO表面にグラフト化すると細胞毒性が大幅に減少することを観察しました。葉酸受容体はさまざまな癌細胞表面で過剰発現しており、特に化学療法前後で卵巣がん細胞に見られます[27]。標的遺伝子送達のため、葉酸分子をGOと共有結合させて葉酸受容体を標的としました。

全体として、本研究の主目的は、卵巣がんのsiRNAベース遺伝子治療の有用性を高める新しい標的GOベース遺伝子送達システムを探求することでした。得られた正に帯電したPEG-GO-PEI-FAはsiRNAを載せて遺伝子送達に使用できます。その合成成功、特性評価、効果的な細胞内取り込み、in vitro抗がん効果をさまざまな手法で分析しました。また、このシステムの安全性もin vitroで評価しました。

材料と方法

材料

グラフェン酸化物は蘇州カーボンファングラフェンテクノロジー有限公司（中国蘇州）から入手しました。葉酸（FA）、N-ヒドロキシコハク酸イミド（NHS）、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）はシグマアルドリッチトレーディング有限公司（中国上海）から購入しました。分岐PEI 25K、PEG（MW=2000）、アガロース、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（EDC·HCl）はアダマ試薬有限公司（中国上海）から購入しました。リン酸緩衝液（PBS）、デュルベッコリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）、その他すべての化学薬品はシノファームケミカルリエージェント有限公司（中国上海）から購入しました。すべての化学薬品は試薬グレードです。RPMI-1640培地（Gibco）、胎児牛血清（FBS）（Gibco）、トリプシン（Gibco）、20×TAE緩衝液はサーモフィッシャーサイエンティフィック有限公司（中国）から購入しました。セルカウンティングキット8（CCK-8）は上海伊生生物有限公司（中国上海）から購入しました。LysoTracker Red、4%パラホルムアルデヒド、4'-6-ジアミジノ-2-フェニルインダール（DAPI）、リポフェクタミン2000トランスフェクション試薬はインビトロジェン有限公司（中国）から購入しました。Dil蛍光プローブ（カタログ番号：C1036）はベイタイム有限公司から購入しました。Anti-PLK1（PLK1-homo-581）スモールインターフェリングRNA（siRNA）は上海ジーンファーマ有限公司（中国上海）で合成されました。

PEG-GO-PEI-FAの調製

PEG-GO-PEI-FAの合成は図S2(A)に示す戦略に従って行いました。まず、10mLのGO水懸濁液（1000μg/mL）を50Wで2時間連続バス超音波処理しました。次に、EDC·HCl（5000μg/mL）1mLとNHS（5000μg/mL）を加え、100Wで30分間断続的に超音波処理し、PEG（10mg）を加えて30分間超音波処理し、0℃で磁気撹拌機で6時間撹拌しました。未反応試薬を除去しGO-PEG溶液を得るため、混合物を透析膜（MWCO、3500Da）で蒸留水中24時間透析しました。次に、GO-PEG溶液を30分間超音波処理し、再びEDC·HCl（5000μg/mL）1mLとNHS（5000μg/mL）を加えて30分間超音波処理し、PEI 25K（5000μg/mL）2mLを加えました。混合物を30分間超音波処理し、0℃で6時間撹拌しました。その後、上記手順で蒸留水中透析膜（MWCO、3500Da）で24時間透析してPEG-GO-PEIを得ました。PEG-GO-PEI溶液を60分間超音波処理し、EDC·HCl（5000μg/mL）1mLとNHS（5000μg/mL）を加えて30分間超音波処理し、10mg FAを溶液に加えました。溶液を30分間超音波処理し、0℃で12時間撹拌し、上記手順で48時間透析してPEG-GO-PEI-FAを得ました。ナノコンプレックス溶液を真空凍結乾燥機（Biosafer-10D）で乾燥させました。

特性評価

ナノコンプレックスの水溶液中での表面ゼータ電位と平均粒子径を動的光散乱（DLS、Malvern Zetasizer Nano ZS、英国）で測定しました。ナノコンプレックスの形態を大気中原子間力顕微鏡（AFM、MultiMode Nanoscope IIIa、ドイツ）で観察しました。フーリエ変換赤外分光法（FTIR）スペクトルをサーモニコレット6700 FTIR分光計で、KBrペレット法により400-4000cm⁻¹の範囲で取得しました。ナノコンプレックスのUV-Vis吸収スペクトルをUV-Vis分光光度計（UV、EV300、米国）で測定しました。ナノコンプレックスのラマンスペクトルを分散型ラマン顕微鏡（Senterra R200-L、ドイツ）で励起波長532nmで測定しました。

In Vitro生物安全性アッセイ

SKOV3（ヒト卵巣がん細胞）をキージェン（中国）から購入しました。細胞は10% FBS、100U/mLペニシリン、100g/mLストレプトマイシンを添加したRPMI-1640培地で維持し、5% CO₂含有加湿雰囲気下37℃で培養しました。本研究では、CCK-8アッセイでSKOV3細胞における材料の細胞毒性を分析しました。簡単に説明すると、細胞を96ウェルプレートに6×10³cells/wellの密度で100μLの10% FBS含有1640培地に播種し、5% CO₂含有加湿雰囲気下37℃で12時間インキュベートしました。次に、GO、GO-PEG、PEG-GO-PEI、PEG-GO-PEI-FAを最終濃度10-1000μg/mLの範囲で添加し、さらに12時間インキュベートしました。別途、GO、GO-PEG、PEG-GO-PEI、PEG-GO-PEI-FAを100μg/mLの濃度で4-24時間の異なる時間インキュベートしました。その後、各ウェルに10μLのCCK-8を添加し、37℃でさらに3時間インキュベートしました。その後、マイクロプレートリーダーで450nmの吸光度を測定しました。各群の実験を3回繰り返しました。培地で培養した対照細胞に対する相対細胞生存率（%）は、（サンプル吸光度-ブランク吸光度）/（対照吸光度-ブランク吸光度）×100%で計算しました。

アガロースゲル遅延アッセイ

20×TAE緩衝液をDEPC処理水で希釈して1%アガロース溶液を作製しました。その後、電子レンジで5分間加熱してアガロースを完全に溶解させました。アガロース溶液の温度が55℃まで下がったとき、エチジウムブロミド（EB、0.5μg/mL）溶液を体積比10,000:1で加え均一に混合し、冷却してアガロースゲルを形成しました。PEG-GO-PEI、PEG-GO-PEI-FA、siRNA混合物を異なる重量比でウェルに添加しました。ゲルを110V、40mAで約60分間走らせ、紫外線イメージャーで観察・分析しました。

PEG-GO-PEI-FAの細胞取り込み研究

細胞取り込みを調査するため、ナノコンプレックスを先行研究で記載された方法でわずかな修正を加えてFITCで標識しました[28]。簡単に説明すると、ナノコンプレックス溶液（約1mg/mL、2.0mL）をDMSOに溶解したFITC（26mM）0.2mLと混合し、室温で一晩撹拌しました。その結果得られた混合物を5000MWCO膜で透析して未標識FITCを除去し、凍結乾燥させました。細胞を6ウェルプレート（カバースリップ含む）に2×10⁵cells/wellの密度で2mLの10% FBS含有1640培地に播種し、細胞培養インキュベーターで37℃、12時間インキュベートしました。次に、各ウェルの培地を無血清1640培地に置き換えました。その後、異なるナノコンプレックス/FITCで細胞を処理しました。ナノコンプレックスなしで処理した細胞を対照群、PEI 25Kで処理した細胞を並行対照群としました。5% CO₂含有加湿雰囲気下37℃で4時間インキュベート後、培養プレートの液体を除去し、冷DPBS（pH=7.4）で2回洗浄し、各ウェルに20μL DAPIと5μL Dil（細胞膜染料）を添加し、暗所で37℃、20分間インキュベートしました。その後、培地のDAPIとDilを除去し、冷DPBS（pH=7.4）で2回洗浄し、細胞のカバースリップを取り出し、Permount TMマウンティング媒体でガラススライドに固定しました。その後、共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）で細胞スライドの蛍光信号を観察し、ナノコンプレックスの細胞取り込みを分析しました。

エンドソーム脱出と核への侵入

細胞内分布、エンドソーム脱出、ナノコンプレックスの核侵入を可視化するため、SKOV3細胞を12ウェルプレート（カバースリップ含む）に1×10⁵cells/wellの密度で2mLの10% FBS含有1640培地に播種し、37℃、5% CO₂で12時間インキュベートしました。次に、各ウェルの培地を1mL/wellの無血清1640培地に置き換えました。その後、異なるナノコンプレックス（100μg/mL）をFITCで標識して12ウェルプレートに1mL/well添加しました。6時間後、液体を除去し、冷DPBS（pH=7.4）で2回洗浄し、12ウェルプレートにLysoTracker Red（5μg/mL）を50μL/well添加しました。5% CO₂含有加湿雰囲気下37℃で15分間インキュベート後、12ウェルプレートの液体を除去し、冷DPBS（pH=7.4）で2回洗浄し、各ウェルに20μL DAPIを添加し、暗所で4℃、20分間インキュベートしました。次に、DAPI液を除去し、冷DPBS（pH=7.4）で2回洗浄しました。その後、4%パラホルムアルデヒドで室温15分間固定し、カバースリップを取り出し、Permount TMマウンティング媒体でガラススライドに固定しました。共焦点レーザー走査顕微鏡でスライドの蛍光信号を観察し、ナノコンプレックスのリソソーム脱出と核侵入を分析しました[29]。

細胞阻害分析

CCK-8アッセイを用いてPEG-GO-PEI/siRNAとPEG-GO-PEI-FA/siRNAの細胞阻害効果を分析しました。簡単に説明すると、細胞を96ウェルプレートに6×10³cells/wellの密度で100μLの10% FBS含有1640培地に播種し、5% CO₂含有加湿雰囲気下37℃で12時間インキュベートしました。次に、PEG-GO-PEIとPEG-GO-PEI-FAを最終濃度10-500μg/mLの範囲で添加し、さらに12時間と24時間インキュベートしました。次に、PEG-GO-PEI/siRNAとPEG-GO-PEI-FA/siRNAを100μg/mLの濃度で4-48時間細胞とインキュベートしました。リポフェクタミン2000でトランスフェクションしたsiRNAと未処理を対照群としました。その後、各ウェルに10μLのCCK-8を添加し、37℃でさらに3時間インキュベートしました。450nmで吸光度を測定しました。各群の実験を3回繰り返しました。阻害率（%）は1-(サンプル吸光度-ブランク吸光度)/(対照吸光度-ブランク吸光度)×100%で計算しました。

統計解析

各実験を3回繰り返し、データをSPSS 17.0ソフトウェアで分析しました。多群解析には一方向分散分析（ANOVA）、二群解析には対応のないStudentのt検定を用いました。データを平均±標準偏差（SD）で表し、統計的有意水準をp<0.05に設定しました。

結果と考察

PEG-GO-PEI-FAの合成

まず、がん細胞株百科事典（CCLE；https://portals.broadinstitute.org/ccle）データベース[30]と遺伝子発現プロファイリングインタラクティブ解析（GEPIA2；https://gepia2.cancer-pku.cn）データベース[31]に基づき、さまざまながん細胞株と卵巣のさまざまな組織でのFR発現を解析しました。結果は先行研究と一致しました（図S1）。したがって、FAを遺伝子送達の標的リガンドとして選択しました。

グラフェン酸化物は酸化プロセスによって生成される縁のカルボキシル、基底面の水酸基、エポキシ基など多くの酸素含有基を確かに持っています[32]。ナノスケールGO（NGO）を得るため、GOを50Wで2時間連続バス超音波処理で連続的にクラックさせ、EDC/NHS化学を用いてPEG/PEI/FAをGOに共有結合させました（図S2(A)）。図S2(B)にPEG-GO-PEI-FA/siRNAの処理経路を示します。化学結合の分析はFTIR差分スペクトル技術で行い、スペクトル吸収ピークを取得しました[33]。図1aに示すように、GOにはOH（3425cm⁻¹）、C=O（1719cm⁻¹）、C-H（1350cm⁻¹）官能基の存在が見られ、GO表面に水酸基とカルボキシルの存在を示しています。PEGがGOと安定な共有結合で反応するとCH（2885cm⁻¹）伸縮振動バンドが見られ、PEGがGOにグラフト化されたことを示し、PEG結合効率は約6%でした。PEIとFAがGOと反応すると、NH（1590cm⁻¹）、C-N（1420cm⁻¹）伸縮振動バンドが観察され、PEIとFAがエステル化によりGOにグラフト化されたことを示しました。これらの結果は、PEG-GO-PEI-FA結合体が成功裏に合成されたことを実証しました。

図1bにGO、FA、GO-PEG、PEG-GO-PEI、PEG-GO-PEI-FAのUV-Vis吸収スペクトルを示します。GOは223nmに吸収ピークを持ちました。FAは275nmに吸収ピークを持ちました。GO-PEGは滑らかな曲線を示し、PEGがGOと結合してGOの山をより滑らかにしたことを示します。PEG-GO-PEIは219nmに吸収ピークを持ち、PEIがGO-PEG表面にグラフト化されたことを示します。PEG-GO-PEI-FAは219nmと275nmに吸収ピークを持ち、FAがPEG-GO-PEIにグラフト化されたことを示します。これらすべての結果がPEG-GO-PEI-FAの成功合成をさらに実証しました。

PEG-GO-PEI-FAの特性評価

表1にナノコンプレックスの粒子径とゼータ電位のデータを示します。PEG、PEI、FAがGO表面に段階的にグラフト化されるにつれ、ナノコンプレックスの粒子径は徐々に218.4nmに増加しました。PEIがGOに結合するとゼータ電位が-16.5から+17.5mVに変化し、静電相互作用による負に帯電したDNAやRNAの吸着能と細胞取り込みを促進しました。PEG-GO-PEI-FAとPEG-GO-PEI-FA/siRNAのゼータ電位はそれぞれ+14.7mVと+14.5mVでした。FAとsiRNAの負電荷のため、PEG-GO-PEI-FAまたはPEG-GO-PEI-FA/siRNAのゼータ電位はPEG-GO-PEIより小さくなりました。これらは、PEG-GO-PEI-FA/siRNAが電荷相互作用で細胞表面に吸着し、細胞膜上の受容体媒介性エンドサイトーシスで利用される可能性を示しています[34]。

ナノキャリアの表面形態と粒子径もAFMとDLSで測定しました。図2aに示すように、GOは粒子径192.1nmの滑らかな表面とシート構造を示しました。PEG、PEI、FAをGO表面にグラフト化後、PEG-GO-PEI-FAの粒子径は216.1nmに増加し、PEG-GO-PEI-FA表面に多くの突起が観察されました（図2b）、大量の修飾がGOシートに固定化されたことを示唆します。同時に、PEG-GO-PEI-FAの高さはGOより大きく、これは主にGOシートの両面にPEG、PEI、FAが付着したためです。

ラマン分光法はナノ炭素材料の特性評価と構造的特性の測定に最も一般的に使用される手法の1つです[35]。図2cに示すように、GOのラマンスペクトルは1600cm⁻¹（Gバンド）と1354cm⁻¹（Dバンド）に振動バンドを示し、ID/IGの面積比は1.0385で、GOのsp²混成部分が破壊され水酸基とカルボキシルが形成されたことを示しています。GO-PEGとPEG-GO-PEIは1595cm⁻¹（Gバンド）と1352cm⁻¹（Dバンド）に振動バンドを示し、ID/IGの面積比はそれぞれ0.7737と0.5238でした。PEGとPEIがGOと反応するにつれてID/IGの面積比が徐々に減少し、PEGとPEIがGO表面にグラフト化されたことを示しています。

さまざまな官能基化NGOのIn Vitro生物安全性分析

非ウイルス遺伝子ベクターの生物安全性問題は臨床応用への重要な課題となっています。高い正電荷は遺伝子を凝縮・保護する優れた能力をもたらす一方で、重度の細胞毒性を引き起こします[36, 37]。フリーsiRNAナノコンプレックスの細胞毒性をテストするため、CCK-8アッセイを実施し、SKOV3細胞を10-1000μg/mLの異なる濃度のフリーナノコンプレックスで4、8、12、24時間インキュベートしました。図S3に示すように、ナノコンプレックスは1000μg/mL、24時間でも卵巣がんで高い細胞生存率を維持しました。すべてのナノコンプレックスの細胞毒性は時間と濃度依存的でした（SKOV3細胞の生存率：すべてのナノコンプレックスで1000μg/mLで≥84.38%、24時間で≥94.21%）。これらの結果は、ナノコンプレックスが無視できる細胞毒性を示し、生体適合性遺伝子ベクターとして機能できることを示唆しています。

siRNAと結合したナノコンプレックスの分析

フリーRNA分子の細胞取り込みは、それらが持つ実質的な負電荷のため通常困難です[38]。陽イオン性ポリマーによる負に帯電した生体分子の担持はこの問題を解決するために広く採用されています[39]。本論文では、siRNAをPEG-GO-PEI-FAベクターに水溶液中でsiRNAとPEG-GO-PEI-FAを混合することで担持させました。表1に示すように、PEG-GO-PEI-FAのゼータ電位は+14.7mVで、siRNAが静電相互作用でPEG-GO-PEI-FA表面に吸着可能であることを示しています。本研究では、アガロースゲル電気泳動でナノコンプレックスの遺伝子凝縮能を評価しました[40]。図3aに示すように、PEG-GO-PEIは重量比10でsiRNAに明確な凝縮能を示しましたが、PEG-GO-PEI-FAでは重量比20でsiRNA移動の完全遅延が観察されました（図3b）。したがって、PEG-GO-PEI-FAはsiRNAを分解から保護できますが、同時に良好な結合能を示すにはもう少し多くのナノコンプレックスが必要です。これはPEG-GO-PEI-FAのゼータ電位がそれほど高くないことに関連している可能性があります。これらの結果は、PEG-GO-PEIとPEG-GO-PEI-FAが十分な送達能を持ち、特にPEG-GO-PEI-FAが遺伝子の効率的かつ安全な送達のための有効なベクターとしての可能性をさらに示しています。

細胞取り込み分析

キャリアが特定的に腫瘍を標的できるかどうかは遺伝子送達にとって極めて重要です。PEG-GO-PEI-FAキャリアが容易に細胞に入れるかどうかを確認するため、FITCを細胞内イメージング用蛍光プローブとして使用しました。同時に、核をDAPIで、細胞膜をDilで染色しました。図4に示すように、対照群とPEG-GO-PEI群は核周りと細胞膜周りに緑色蛍光信号を示しませんでした。これはPEG-GO-PEIが細胞に入らなかったことを示唆します。PEI 25KとPEG-GO-PEI-FA/siRNAは核周りに緑色蛍光信号として現れ、PEG-GO-PEI-FAが細胞膜を透過して細胞に入れることを明確に実証しました。PEG-GO-PEI-FAナノコンプレックスは最も活発な細胞取り込みを示し、これはFAがSKOV3細胞表面で過剰発現しているFRに特異的に結合できることに起因する可能性があります。これらの結果は、FAがPEG-GO-PEI-FAとPEG-GO-PEI-FA/siRNAナノコンプレックスの効率的な細胞取り込みを媒介する上で重要な役割を果たすことを示唆しています。より重要なのは、FAの受容体結合能力が共有アミド結合の影響を受けず、受容体媒介性エンドサイトーシスが妨げられないことです。

リソソーム脱出分析

siRNA送達システムでは、エンドソームまたは形成されたリソソームから脱出する必要があります。そうでない場合、siRNAは分解されるか細胞外に排出されます[41-43]。CLSMを用いたナノコンプレックスの細胞内局在によりエンドソーム脱出能を評価しました。多くの報告がPEI 25Kが「プロトンスポンジ効果」でエンドソームまたはリソソーム脱出を促進することを実証しているため[44]、PEI 25Kを対照として使用しました。本研究では、ナノコンプレックスをFITCで標識しました。まず、FITCの緑色蛍光信号とLysoTracker Redの赤色蛍光信号が重なる黄色信号により、ナノコンプレックスがリソソームに入ったかどうかを推定しました。PEI 25Kは細胞と4時間インキュベート後に黄色信号として現れ、他の材料は2時間後に黄色信号として現れ、材料が細胞に入ったことを示唆しました（図5）。ナノコンプレックスがリソソームから脱出したかどうかは、FITCの緑色蛍光信号とDAPIの青色蛍光信号が合わさった明るいシアン信号で判断しました。図5aに示すように、緑色信号が核に蓄積しているのが観察され、PEI/siRNAを細胞と8時間インキュベート後に明るいシアン信号があり、PEI/siRNAがリソソームから脱出したことを示しています。しかし、PEG-GO-PEI-FAとPEG-GO-PEI-FA/siRNAはわずか2時間で核に弱い緑色信号が侵入し、インキュベーション時間の増加とともにより多くの緑色信号が核に蓄積しました。PEG-GO-PEI-FAとPEG-GO-PEI-FA/siRNAを細胞と4時間インキュベート時に明るいシアン信号がありました（図5b、c）。これらは、材料が早期にリソソームから脱出したことを示しています。要するに、これらの結果はPEG-GO-PEI-FAとPEG-GO-PEI-FA/siRNAが優れたエンドソームまたはリソソーム脱出能を保持し、in vitroで効率的にリソソーム脱出と遺伝子トランスフェクションを促進できることを示しています。

PEG-GO-PEI-FA/siRNAの細胞阻害評価

現在のケースでは、PEG-GO-PEI-FA/siRNAの治療効果をSKOV3細胞でin vitroのCCK-8アッセイで検証しました。図6aに示すように、PEG-GO-PEI-FA群では異なる濃度（10-100μg/mL）と異なる時点（12時間と24時間）で腫瘍細胞の生存率に有意な影響は見られませんでした。濃度が100μg/mLを超えても、腫瘍細胞の生存率は80%以上でした。したがって、次の細胞阻害研究で100μg/mLを選択しました。PEG-GO-PEI/siRNAとLipo2000/siRNA群ではより弱い細胞毒性が示されました（阻害率20%未満）。PEG-GO-PEI/siRNAとLipo2000/siRNAと比較して、PEG-GO-PEI-FA/siRNAはSKOV3腫瘍細胞の増殖に有意な阻害効果を示しました。PEG-GO-PEI-FA/siRNAは時間依存的にSKOV3細胞を阻害しました（図6b）。これらの結果は、PEG-GO-PEI-FA/siRNAが腫瘍細胞増殖の増加に対する最良の阻害効果を持ち、PEG-GO-PEI-FAを遺伝子送達の理想的なナノキャリアとして使用できることを示しています。

結論

本研究では、新規遺伝子送達システムPEG-GO-PEI-FAを成功裏に合成しました。PEG-GO-PEI-FA自体は細胞毒性がなく優れた生物学的適合性を持ち、安全で効果的な遺伝子送達ベクターとしての展望を保証しています。PEG-GO-PEI-FA/siRNAナノコンプレックスは遺伝子標的送達のための優れた物理化学的特性を示しました。さらに、PEG-GO-PEI-FA/siRNAはSKOV3卵巣がん細胞に容易に入り、リソソームから脱出できます。細胞毒性アッセイは、PEG-GO-PEI-FA/siRNAが時間依存的に卵巣がん細胞に良好な阻害効果を持ち、他の群と比較してより高い細胞毒性効果を示すことを実証しました。上記結果に基づき、PEG-GO-PEI-FAは標的遺伝子送達のための遺伝子ベクターとして、卵巣癌治療におけるより効果的な戦略として良い期待を提供する可能性があります。